聚乙烯亞胺-蛋白納米復(fù)合體轉(zhuǎn)染蛋白進(jìn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用研究*

姜　霖，吳岳恒，李曉紅，潘　宇，肖　靜，楊翔宇，馮　媛，余細(xì)勇△(南方醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州5055;廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東廣州50080)

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聚乙烯亞胺-蛋白納米復(fù)合體轉(zhuǎn)染蛋白進(jìn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用研究*

姜霖1，2，吳岳恒2，李曉紅2，潘宇2，肖靜2，楊翔宇2，馮媛3，余細(xì)勇2△
(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州510515;2廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省心血管病研究所，3廣東省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東廣州510080)

［摘要］目的:探索納米材料聚乙烯亞胺(PEI)攜載不同分子量的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)的作用及優(yōu)化其最佳配比條件。方法:利用物理化學(xué)作用構(gòu)建6組PEI-DNase I(DNA酶I)復(fù)合體，運(yùn)用激光散射技術(shù)初步摸索其最佳摩爾比，用透射電鏡直觀復(fù)原納米-蛋白復(fù)合體外貌;同時(shí)，原代分離培養(yǎng)健康人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行體外擴(kuò)增，通過(guò)構(gòu)建成功的4組PEI-GFP(綠色熒光蛋白)納米蛋白復(fù)合體對(duì)hBMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，共聚焦熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，再通過(guò)MTT法檢測(cè)該復(fù)合體對(duì)細(xì)胞增殖的毒性影響，并用β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其轉(zhuǎn)入蛋白的活性表現(xiàn)。結(jié)果:當(dāng)PEI與蛋白質(zhì)的摩爾比為4∶1時(shí)，形成的復(fù)合體轉(zhuǎn)染效率最高，β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)細(xì)胞染色變藍(lán)。結(jié)論: PEI能與蛋白質(zhì)形成納米復(fù)合體，并能轉(zhuǎn)染多種蛋白質(zhì)進(jìn)入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，所轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)分子仍具有活性，為細(xì)胞重編程技術(shù)提供了新途徑。

［關(guān)鍵詞］聚乙烯亞胺;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染

［修回日期］2015-04-23

Proteins are transfected into bone marrow mesenchymal stem cells by polyethyleneimine-protein nano-complexes

JIANG Lin1，2，WU Yue-heng2，LI Xiao-hong2，PAN Yu2，XIAO Jing2，YANG Xiang-yu2，F(xiàn)ENG Yuan3，YU Xi-yong2
(1Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Guangdong Cardiovascular Institute，Guangdong General Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences，3Department of Rheumatology，Guangdong General Hospital，Guangzhou 510080，China.E-mail: yuxycn@ aliyun.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the role of encapsulated protein transfected into human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) by polyethyleneimine (PEI)，and to optimize the best mole ratio of PEI-proteins.METHODS: 6 groups of DNase I-PEI complexes were constructed and the best mole ratio was explored by laser scattering analysis.The appearance of complexes was presented under transmission electron microscope.Meanwhile，4 groups of constructed GFP-PEI complexes were utilized to transfect into the hBMSCs，which were isolated and expand in vitro.The fluorescence intensity of transfected cells was observed under confocal microscope.In addition，the cytotoxicity of the complexes on the cell proliferation was detected by MTT assay.The activity of the intracellular proteins was testified by a β-galactosidase staining experiment.RESULTS: When the mole ratio of PEI and protein was adjusted to 4∶1，the complex transfection efficiency was the best，and β-galactosidase color test turned blue.CONCLUSION: PEI has the character of encapsulating various proteins to nano-complexes.The proteins transfected into bone marrow mesenchymal stem cells are confirmed to have functional activity.As a protein carrier，PEI is of high efficiency and low toxicity，thus providing a new way for stem cell reprogramming.

［KEY WORDS］Polyethyleneimine; Bone marrow mesenchymal stem cells; Protein transfection

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)是一門(mén)新興的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是直接把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入活細(xì)胞的過(guò)程。目標(biāo)蛋白質(zhì)一般要在載體的幫助下，與載體形成復(fù)合體而被轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞有非常重要的科研價(jià)值和應(yīng)用前景，主要研究有: (1)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用; (2)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié); (3)未知蛋白質(zhì)的功能; (4)干細(xì)胞重編程等轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域; (5)功能性轉(zhuǎn)錄因子的遞送和癌癥治療［1-4］。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)的提出，不僅在方法學(xué)上促進(jìn)了該領(lǐng)域及相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，并且拓展了人們對(duì)外源性蛋白質(zhì)分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與調(diào)控的應(yīng)用。

目前有關(guān)蛋白質(zhì)載體進(jìn)入細(xì)胞研究的報(bào)道較少，主要原因之一是基因轉(zhuǎn)染的普及和成熟，因?yàn)閷⒒蜣D(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后會(huì)翻譯成蛋白質(zhì)，且已有大量性能穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)染載體，如病毒、脂質(zhì)體、納米載體如聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)等。其中病毒效率最高，但有不可控風(fēng)險(xiǎn)，脂質(zhì)體一般認(rèn)為對(duì)細(xì)胞毒性較大，而納米載體因?yàn)槌叽缧?yīng)和非病毒性，一般認(rèn)為比較有潛力成為更安全可靠的基因載體，所以本領(lǐng)域的研究通常集中在對(duì)納米載體改性，如在不增加載體細(xì)胞毒性的前提下，提高基因轉(zhuǎn)染的效率［5］。

那么就蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染而言，科學(xué)家們?cè)鴩L試使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體、穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)、多聚賴(lài)氨酸(poly-L-lysine，PLL)［6-7］等物質(zhì)來(lái)運(yùn)載蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，但受其轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性的影響，大大限制了它們的應(yīng)用，而且主要應(yīng)用的細(xì)胞種類(lèi)較少，基本沒(méi)有應(yīng)用于干細(xì)胞領(lǐng)域。目前，基于陽(yáng)離子的納米載體PEI被認(rèn)為是最有前途的蛋白載體工具之一，其轉(zhuǎn)染效率高，分子量易于控制，安全性較佳，結(jié)構(gòu)靈活，易于引入特異性靶向基團(tuán)對(duì)復(fù)合體進(jìn)行修飾從而改善性能。本研究通過(guò)構(gòu)建聚乙烯亞胺－蛋白納米復(fù)合體(PEI-protein nano-complexes)，觀察PEI能否轉(zhuǎn)染不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)，并考察轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)是否具有活性。

材料和方法

1材料

1.1骨髓來(lái)源取自廣東省人民醫(yī)院風(fēng)濕科20～40歲受試者髂前上棘，術(shù)前受試者簽署知情同意書(shū)。

1.2試劑與儀器人骨髓間充質(zhì)培養(yǎng)基購(gòu)自廣州賽業(yè)生物科技有限公司; PEI和β-半乳糖苷酶購(gòu)自Sigma; DNA上樣緩沖液和DNA marker購(gòu)自TaKa-Ra; DNase I購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)購(gòu)自義翹神州生物技術(shù)有限公司; Hoechst 33342、PBS購(gòu)自Life Technologies;β-半乳糖苷酶染色試劑盒套裝購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司; MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司;精密電子天平購(gòu)自SHIMADZU;激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自Leica;流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman。

2方法

2.1 hBMSCs的分離、培養(yǎng)及體外擴(kuò)增采用全骨髓貼壁法，取20～40歲健康人髂前上棘內(nèi)骨髓3 mL(涂片有骨髓小粒為佳)，混勻后直接加入5 mL復(fù)溫后的人骨髓間充質(zhì)培養(yǎng)基中(10% FBS)，于5% CO2、37℃培養(yǎng)。72 h后，換PBS溶液清洗3次，常規(guī)培養(yǎng)。約7～10 d后，原代細(xì)胞貼壁充分，生長(zhǎng)融合接近90%后，用0.02% EDTA+ 0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1∶3進(jìn)行傳代。

2.2 hBMSCs的表型鑒定取第3代的hBMSCs消化形成單細(xì)胞懸液，用PBS溶液清洗1次，1 200 r/min離心3 min后再用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×109/L。接著，在收獲的干細(xì)胞懸液中分別加入熒光素標(biāo)記的抗體: FITC-anti human CD45、CD90和CD44; PE-anti human CD29、CD33、CD34、CD105和CD117。混勻后，除CD117于4℃冰箱中孵育30 min，其余皆在室溫下孵育30 min，后1 200 r/min離心3 min，棄去上清，用PBS清洗1次，直接上FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3 PEI-DNase I復(fù)合體和PEI-GFP復(fù)合體的構(gòu)建

PEI－DNase I復(fù)合體設(shè)為4個(gè)處理組，分別加入200 μL 100 mg/L的DNase I溶液，每組再依次加入3.4 μL、1.7 μL、0.9 μL和0.5 μL的PEI溶液的原溶液(8 g/L)，即各組納米粒子與蛋白質(zhì)的摩爾比依次為16∶1、8∶1、4∶1和2∶1，最后用PBS定容至400 μL，4℃過(guò)夜攪拌。

PEI-GFP復(fù)合體同樣設(shè)為4個(gè)處理組，分別加入200 μL 100 mg/L的GFP蛋白溶液和200μL的PBS溶液，接著每組依次加1.6 μL、0.8 μL、0.4 μL和0.2 μL的PEI溶液的原溶液(8 g/L)，即各組納米粒子與蛋白質(zhì)的摩爾比值依次為16∶1、8∶1、4∶1和2∶1，4℃過(guò)夜攪拌。

2.4 PEI-DNase I復(fù)合體的激光散射粒徑測(cè)試和透射電鏡觀察在激光散射粒徑測(cè)試中，單獨(dú)PEI對(duì)照組為1 g/L的PEI溶液，單獨(dú)DNase I對(duì)照組為50 mg/L的DNase I溶液，其余4個(gè)處理組分別為上述構(gòu)建的PEI-DNase I復(fù)合體(其摩爾比為2∶1、4∶1、8∶1和16∶1)溶液。經(jīng)過(guò)50 Hz水浴超聲20 s后，各取400 μL加入預(yù)先潤(rùn)洗過(guò)的激光散射比色皿中，蓋上兩側(cè)蓋子，進(jìn)行測(cè)試。

可選擇上述構(gòu)建的納米-蛋白質(zhì)復(fù)合體中摩爾數(shù)比值為4∶1組，滴加超聲后的復(fù)合體液體50 μL于銅網(wǎng)上，干燥后在透射電鏡下觀察復(fù)合體形態(tài)。

2.5 PEI-GFP復(fù)合體轉(zhuǎn)染hBMSCs的熒光效果圖及細(xì)胞增殖毒性的檢測(cè)如上述，構(gòu)建而成的4組PEI-GFP復(fù)合體溶液蛋白原始濃度為50 mg/L，在3 cm confocal小皿中接種第3代的hBMSCs，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至70%左右，則可用含有PEI-GFP復(fù)合體(蛋白終濃度為5 mg/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即450 μL培養(yǎng)基中分別添加4組50 μL 50 mg/L的PEI-GFP復(fù)合體溶液，5% CO2、37℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗3次，每次5 min，接著復(fù)染Hoechst 33342 5 min，再用PBS溶液清洗3次，每次5 min，可將活細(xì)胞放至激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)入GFP的熒光表達(dá)強(qiáng)弱。

在96孔板里接種hBMSCs 100 μL(約1×104)，置于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;設(shè)為7個(gè)濃度組:每孔分別加入終濃度為64、32、16、8、4、2 和1 mg/L的PEI-GFP復(fù)合體(直接用培養(yǎng)基稀釋?zhuān)瑵舛劝吹鞍诐舛扔?jì)，PEI-GFP摩爾比為4∶1)，繼續(xù)放置于5% CO2、37℃及100%濕度的培養(yǎng)箱中孵育，于第3天時(shí)收板，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入50 μL 1× MTT溶液，在37℃孵育4 h，使MTT還原為甲臜;后吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO使甲臜溶解，用平板搖床搖勻;酶標(biāo)儀550 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度。

2.6 β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEI復(fù)合的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞后的表達(dá)活性稱(chēng)取1 mg的β-半乳糖苷酶粉末，用1 mL PBS溶解，配置成1 g/L的酶溶液，加入5.2 μL的PEI原溶液(8 g/L)，混勻后4℃攪拌30 h，構(gòu)建PEI-β-半乳糖苷酶復(fù)合體。在12孔板中接種第3代的hBMSCs，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至70%左右，用含有PEI-β-半乳糖苷酶復(fù)合體(蛋白濃度為50 mg/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即1 mL培養(yǎng)基中添加50 μL 1 g/L的PEI-GFP復(fù)合體溶液，5% CO2、37℃培養(yǎng)48 h(前6 h不加血清處理，后加10%血清)，后吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，加入500 μL試劑盒內(nèi)的細(xì)胞固定液，室溫固定10 min，吸去固定液，PBS清洗3次，每次3 min，每孔加入1 mL染色液，37℃孵育過(guò)夜，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1不同配比下構(gòu)建的PEI-DNase I復(fù)合體的粒徑檢測(cè)結(jié)果

激光散射粒徑檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)PEI與DNase I的摩爾比為1∶2和1∶16時(shí)，幾乎不能形成復(fù)合體的結(jié)構(gòu);而當(dāng)PEI與DNase I的摩爾比在1∶4和1∶8時(shí)，激光散射強(qiáng)度結(jié)果很明顯地顯示溶液相里形成了眾多幾百納米的復(fù)合體物質(zhì);相較1∶8的配比條件，復(fù)合體在1∶4配比下的粒徑更加小(＜500 nm)，且分布更加均勻，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The laser scattering diameter test of different mole ratios of PEI-DNase I complexes.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs other guoups.圖1不同摩爾比下PEI-DNase I復(fù)合體的激光散射粒徑檢測(cè)

2合適摩爾比下PEI-DNase I復(fù)合體的透射電鏡結(jié)果

由激光散射粒徑檢測(cè)可知PEI與DNase I較佳的摩爾配比條件，因此，我們選擇了配比為4∶1時(shí)構(gòu)建的PEI-DNase I復(fù)合體做透射電鏡觀察，從大體觀，合成的復(fù)合體粒子均勻散布，大部分呈致密的球狀體，而從局部觀，粒子大小較為一致，其直徑大約在200～500 nm，而對(duì)照組PEI納米粒子在電鏡下則較難成像，理論上其粒徑大約在0.5～10 nm左右，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The appearance of PEI-DNase I complexes in best mole ratio (4∶1) under TEM (×93 000).圖2 PEI與DNase I的摩爾比為4∶1時(shí)構(gòu)建的PEI-DNase I復(fù)合體透射電鏡圖

3人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型鑒定

hBMSCs表達(dá)CD29、CD33、CD34、CD44、CD45、 CD90、CD105和CD117的百分率分別為(99.11± 0.60) %、(98.70±0.90 ) %、(0.32±0.20 ) %、(97.87±1.40) %、(0.22±0.20) %、(56.20± 11.20) %、(97.32±1.60) %和(0.27±0.10) %。其中，CD29、CD33、CD44和CD105為陽(yáng)性表達(dá)，而CD34、CD45和CD117基本為陰性表達(dá)，CD90的表達(dá)不穩(wěn)定，浮動(dòng)較大。CD29和CD44都是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的公認(rèn)的標(biāo)志，CD34則為造血干細(xì)胞的主要標(biāo)志之一，CD45為白細(xì)胞的標(biāo)志物，CD117近來(lái)多用于心臟干細(xì)胞的表型認(rèn)證。因此，根據(jù)流式細(xì)胞檢測(cè)得到的結(jié)果，可以得出原代分離出的hBMSCs性質(zhì)較為均一，具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Phenotype of hBMSCs detected by flow cytometer.圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hBMSCs的表面標(biāo)志

4構(gòu)建的PEI-GFP蛋白復(fù)合體粒子轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

當(dāng)PEI與GFP配比合適時(shí)，PEI能夠以復(fù)合體的形式高效攜載GFP蛋白穿膜并在胞內(nèi)釋放并表達(dá)GFP，從而顯示出綠色熒光。當(dāng)PEI與GFP蛋白的摩爾比為2∶1時(shí)，PEI就不足以攜載GFP蛋白而不能形成完整的復(fù)合體，因此熒光表達(dá)明顯偏低;而PEI與GFP蛋白配比相對(duì)較高時(shí)，多余的PEI可能會(huì)影響二者的自組裝過(guò)程，并且PEI表面大量的正電荷可能會(huì)影響細(xì)胞引起細(xì)胞的聚集效應(yīng)，綜合這些因素，當(dāng)PEI與GFP蛋白粒子的摩爾比為4∶1時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞的GFP熒光表達(dá)量較多，且通過(guò)熒光表達(dá)可見(jiàn)PEI-GFP復(fù)合體對(duì)hBMSCs的轉(zhuǎn)染效率幾乎為100%，見(jiàn)圖4。

5 MTT法檢測(cè)hBMSCs經(jīng)PEI-GFP復(fù)合體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖能力

分別將7組不同濃度的PEI-GFP復(fù)合體轉(zhuǎn)染hBMSCs，3天后利用MTT法對(duì)處理的細(xì)胞進(jìn)行增殖毒性的檢測(cè)。復(fù)合體的轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的存活率存在一定的影響，當(dāng)1 mg/L的復(fù)合體轉(zhuǎn)染hBMSCs時(shí)，其存活率大約下降20%，若以此為對(duì)照，當(dāng)轉(zhuǎn)染的復(fù)合體濃度高于4 mg/L時(shí)，復(fù)合體對(duì)細(xì)胞的毒性作用就有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著復(fù)合體轉(zhuǎn)染濃度的提高，其對(duì)hBMSCs增殖的影響也就越來(lái)越大，也就意味著毒性作用增大，當(dāng)高于32 mg/L時(shí)，被處理的細(xì)胞基本沒(méi)有了增殖活性，見(jiàn)圖5。

Figure 4.The fluorescence expression of PEI-GFP complexes constructed by 4 mole ratios after transfected into hBMSCs.圖4 4種摩爾比的PEI-GFP復(fù)合體轉(zhuǎn)染hBMSCs后的熒光表達(dá)情況

Figure 5.Detection of cytotoxicity by MTT method on the 3th day.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 1 mg/L.圖5 MTT法檢測(cè)不同濃度的PEI-GFP復(fù)合體轉(zhuǎn)染hBMSCs后的細(xì)胞增殖毒性

6顯色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)入hBMSCs的β-半乳糖苷酶活性

理論上，β-半乳糖苷酶能夠作用于底物X-Gal從而顯藍(lán)色，當(dāng)PEI-β-半乳糖苷酶復(fù)合體轉(zhuǎn)入hBMSCs后，加入X-Gal以及染色劑孵育，在光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色，那么則驗(yàn)證了被PEI攜載的β-半乳糖苷酶被轉(zhuǎn)入細(xì)胞后能夠正常表達(dá)并依然具有活性，見(jiàn)圖6。

討論

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，科研者們不斷制造出各種具有特殊性能的納米粒載體并用于基因和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移，包括PLL、PEI、樹(shù)枝狀聚合物(dendrimers)、多聚β-氨基酯(PbAE)、脫乙酰殼多糖(chitosan)及明膠等一系列穿膜載體。這類(lèi)帶正電荷的納米粒子可以通過(guò)氫鍵作用、靜電作用、疏水作用甚至范德華力等物理化學(xué)作用，很容易地與帶負(fù)電荷的基因和蛋白質(zhì)載體接觸并結(jié)合，進(jìn)而對(duì)其展開(kāi)折疊壓縮等自組裝修飾［8］。早在2005年［9］就有了PEI能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行運(yùn)輸轉(zhuǎn)染的報(bào)道，逐漸修飾形成致密均勻的納米球狀復(fù)合體的研究，而這些復(fù)合體在表面效應(yīng)和體積效應(yīng)的作用下，會(huì)逐漸趨于穩(wěn)定。同時(shí)，這也大大開(kāi)啟了PEI的蛋白轉(zhuǎn)染之路，目前，已有學(xué)者運(yùn)用硫酸鹽接枝PEI，再通過(guò)氧化聚合反應(yīng)生成的聚合電解質(zhì)RPC-bPEI來(lái)攜載像BSA、溶解酵素等細(xì)胞質(zhì)蛋白，從電解質(zhì)還原角度來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的傳遞［10］。

眾所周知，蛋白質(zhì)是主導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)作用的終端物質(zhì)，其復(fù)雜而穩(wěn)定的四級(jí)結(jié)構(gòu)及其活性基團(tuán)構(gòu)象都對(duì)細(xì)胞、組織乃至生物體的調(diào)控產(chǎn)生巨大影響。Bao等［11］使用他們構(gòu)建的chitosan-PEI-坎替沙坦(CPC)復(fù)合體聯(lián)合基因治療來(lái)對(duì)抗惡性血管腫瘤，這種CPC復(fù)合體擁有靶向運(yùn)送藥物蛋白的功能，CPC和WT-p53基因的聯(lián)合運(yùn)輸模式更為腫瘤治療提供了一種非常有效的手段，而當(dāng)PEI與吡啶硫脲發(fā)生自組裝后，會(huì)更加有利于運(yùn)輸具有功能活性的小分子抗體以及抗體抑制劑［12］。鑒于不容小覷的蛋白功能，本實(shí)驗(yàn)室則從蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染著手，發(fā)現(xiàn)了只需單純的PEI(1 200 kD)分子，就能夠高效裝載外源性的蛋白質(zhì)分子通過(guò)質(zhì)膜甚至核膜屏障，并能克服宿主細(xì)胞內(nèi)溶酶體、蛋白酶等對(duì)外源蛋白質(zhì)分子的降解，使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮它的活性功能，這無(wú)疑開(kāi)辟了一條基礎(chǔ)過(guò)度臨床應(yīng)用的新道路。

另外，應(yīng)用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)染一直是科研領(lǐng)域頗為薄弱和單一的技術(shù)，hMSCs是具有自我更新和復(fù)制能力，并具有多向分化潛能的細(xì)胞，其“干性”的維持和細(xì)胞本身的特性是轉(zhuǎn)染技術(shù)中亟待克服的兩大硬傷。而目前，hMSCs的轉(zhuǎn)染實(shí)際應(yīng)用最多的仍舊是病毒型載體，它所轉(zhuǎn)染的DNA、siRNA、shRNA、microRNA等基因片段過(guò)表達(dá)或低表達(dá)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域，但是，卻難以擺脫免疫排斥反應(yīng)以及病毒介導(dǎo)的隨機(jī)整合等潛在危害［13］，Moradian等［14］也曾試過(guò)用PEI聯(lián)合碳納米管來(lái)轉(zhuǎn)染eGFP進(jìn)入MSCs，其最高轉(zhuǎn)染效率也只達(dá)82%，而本實(shí)驗(yàn)PEI轉(zhuǎn)染GFP蛋白的效率幾乎達(dá)到100%。本研究中我們分別構(gòu)建了PEI-DNase I、PEI-GFP和 PEI-β-半乳糖苷酶3種納米蛋白復(fù)合體，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是低分子量還是高分子量的蛋白質(zhì)，當(dāng)PEI和蛋白質(zhì)微粒的摩爾比是4∶1～8∶1時(shí)，構(gòu)建的復(fù)合體對(duì)hMSCs的轉(zhuǎn)染效率最佳。目前，利用納米載體轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)分子的研究仍在開(kāi)發(fā)和探索的過(guò)程中，若亞細(xì)胞定位的特異性進(jìn)一步提高后［15］，納米-蛋白轉(zhuǎn)染技術(shù)將具有無(wú)可比擬的應(yīng)用價(jià)值和功能優(yōu)勢(shì)，臨床應(yīng)用前景廣闊。

Figure 6.The expression activity of transfected β-galactosidase tested by color reaction experiment.hBMSCs were inoculated in 12 wells with 70% density，transfected by PEI-β-galactosidase complexes(protein concentration is 50 mg/L)，and incubated in 5% CO2at 37℃for 48 h.圖6 β-半乳糖苷酶顯色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)入hBMSCs的β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性

［參考文獻(xiàn)］

［1］Kostiainen MA，Hiekkataipale P，Laiho A，et al.Electrostatic assembly of binary nanoparticle superlattices using protein cages［J］.Nat Nanotechnol，2013，8(1) :52-56.

［2］盧雪梅，黃演婷，汪潔，等.新型融合多肽HTPPMDC體外抑制HBV復(fù)制活性及亞細(xì)胞定位［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29(7) :1283-1287.

［3］Cho SJ，Choi HW，Cho J，et al.Activation of pluripotency genes by a nanotube-mediated protein delivery system ［J］.Mol Reprod Dev，2013，80(12) :1000-1008.

［4］Nagel D，Behrendt JM，Chimonides GF，et al.Polymeric microspheres as protein transduction reagents［J］.Mol Cell Proteomics，2014，13(6) :1543-1551.

［5］Jin L，Zeng X，Liu M，et al.Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers［J］.Theranostics，2014，4(3) :240-255.

［6］Kato T，Tanaka M，Oba M.Protein transfection study using multicellular tumor spheroids of human hepatoma Huh-7 cells［J］.PLoS One，2013，8(12) : e82876.

［7］劉蓮，余榕捷，戴云，等.重組蛋白PTD-HSP27的制備及其穿細(xì)胞膜和角膜組織的功能研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2015，31(1) :135-140.

［8］Vasquez D，Milusheva R，Baumann P，et al.The amine content of PEGylated chitosan Bombyx mori nanoparticles acts as a trigger for protein delivery［J］.Langmuir，2014，30(4) :965-975.

［9］Didenko VV，Ngo H，Baskin DS.Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies［J］.Anal Biochem，2005，344(2) :168-173.

［10］Tian L，Kang HC，Bae YH.Endosomolytic reducible polymeric electrolytes for cytosolic protein delivery［J］.Biomacromolecules，2013，14(8) :2570-2581.

［11］Bao X，Wang W，Wang C，et al.A chitosan-graft-PEI-candesartan conjugate for targeted co-delivery of drug and gene in anti-angiogenesis cancer therapy［J］.Biomaterials，2014，35(29) :8450-8466.

［12］Postupalenko V，Sibler AP，Desplancq D，et al.Intracellular delivery of functionally active proteins using self-assembling pyridylthiourea-polyethylenimine［J］.J Control Release，2014，178:86-94.

［13］Klein PM，Wagner E.Bioreducible polycations as shuttles for therapeutic nucleic acid and protein transfection［J］.Antioxid Redox Signal，2014，21(5) :804-817.

［14］Moradian H，F(xiàn)asehee H，Keshvari H，et al.Poly(ethyleneimine) functionalized carbon nanotubes as efficient nano-vector for transfecting mesenchymal stem cells［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2014，122:115-125.

［15］Lohcharoenkal W，Wang L，Chen YC，et al.Protein nanoparticles as drug delivery carriers for cancer therapy［J］.Biomed Res Int，2014，2014:180549.

通訊作者△Tel: 020-83827812; E-mail: yuxycn@ aliyun.com

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.81120108003; No.81330007)

［收稿日期］2015-02-26

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1057-07

［中圖分類(lèi)號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.016