骨橋蛋白通過內質網應激誘導C2C12肌細胞胰島素抵抗*

劉　華，陳　昊，唐　照，張葉敏，李明欣，汪長華△(連云港市第一人民醫院病理科，江蘇連云港00;武漢大學基礎醫學院病理生理學教研室，湖北武漢43007)

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骨橋蛋白通過內質網應激誘導C2C12肌細胞胰島素抵抗*

劉華1，陳昊1，唐照2，張葉敏2，李明欣2，汪長華2△
(1連云港市第一人民醫院病理科，江蘇連云港222002;2武漢大學基礎醫學院病理生理學教研室，湖北武漢430071)

［摘要］目的:探討骨橋蛋白(osteopontin，OPN)對C2C12肌細胞胰島素抵抗的影響及其可能的機制。方法:低血清培養輔以胰島素處理誘導C2C12成肌細胞分化為C2C12肌細胞，蛋白免疫印跡檢測蛋白質的表達，離心法分離細胞膜，葡萄糖攝取試劑盒定量葡萄糖攝取。結果: (1)骨橋蛋白以劑量依賴和時間依賴方式抑制胰島素刺激的蛋白激酶B(Akt)的磷酸化，并抑制胰島素所致的葡萄糖轉運體4 (Glut4)膜位移和葡萄糖的攝取;而特異性的抗OPN受體CD44抗體預處理可逆轉上述變化。(2) OPN可誘導C2C12肌細胞的內質網應激，并促進c-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化。(3)內質網應激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)可降低OPN所增加的JNK磷酸化，恢復胰島素刺激所致的Glut4的膜位移以及葡萄糖攝取。結論:骨橋蛋白通過誘導C2C12肌細胞內質網應激導致胰島素抵抗。本研究為揭示骨橋蛋白在胰島素抵抗和糖尿病中的作用提供了新的實驗依據和理論解釋。

［關鍵詞］骨橋蛋白;胰島素抵抗;內質網應激; C2C12肌細胞

［修回日期］2015-01-26

Osteopontin-induced ER stress results in insulin resistance in C2C12 myocytes

LIU Hua1，CHEN Hao1，TANG Zhao2，ZHANG Ye-min2，LI Ming-xin2，WANG Changhua2
(1Department of Pathology，The First People’s Hospital of Lianyungang，Lianyungang 222002，China;2Department of Pathophysiology，Wuhan University School of Basic Medical Sciences，Wuhan 430071，China.E-mail: chwang0525@ whu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the potential role of osteopontin (OPN) in insulin resistance in C2C12 myocytes and its underlying mechanism.METHODS: C2C12 myoblasts were induced by low concentration of serum and insulin treatment to differentiate into myocytes.Western blot was performed to detect the protein abundance and phosphorylation using specific antibodies.Plasma membrane was isolated by centrifugation.Glucose uptake was measured by glucose uptake assay.RESULTS: OPN treatment suppressed insulin-stimulated protein kinase B (Akt) phosphorylation in a dose-and time-dependent manner，accompanied with decreased membrane translocation of glucose transporter type 4 (Glut4) and reduced glucose uptake.Neutralization of OPN specific receptor in skeletal muscle with CD44 antibody mitigated OPN-induced inhibitory impact on insulin action.Furthermore，OPN treatment resulted in endoplasmic reticulum (ER) stress and phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase (JNK).Administration of ER stress inhibitor 4-phenylbutyrate (4-PBA) diminished the detrimental effects of OPN on JNK phosphorylation，Glut4 membrane translocation and glucose uptake.CONCLUSION: ER stress mediated OPN-induced insulin resistance in C2C12 myocytes.

［KEY WORDS］Osteopontin; Insulin resistance; Endoplasmic reticulum stress; C2C12 myocytes

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)表達在多種細胞和組織中，如纖維細胞、巨噬細胞、T細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、內皮細胞、肝細胞、脂肪細胞等，具有多種生物學功能，在炎癥、肥胖、糖尿病等的發生發展中具有重要作用［1］。OPN血漿含量的增高見于肥胖和糖尿病，增加的血漿OPN含量將導致器官的巨噬細胞浸潤、炎癥反應、胰島素抵抗等［2-3］。敲除OPN或者利用抗OPN抗體中和OPN，可防止高脂飲食誘導的脂肪細胞和肝細胞炎癥反應、肝細胞脂肪變、肝葡萄糖異生、系統胰島素抵抗等發生，并最終降低血糖水平［4-6］。

骨骼肌是機體運動時葡萄糖消耗的主要器官之一，其葡萄糖代謝狀態在糖尿病的發生中起至關重要的作用。骨骼肌的胰島素敏感性降低將直接導致其葡萄糖代謝失調，引發血糖增加［7］。研究發現，骨骼肌細胞可產生OPN［1］，并接受OPN的調節［8］，OPN可影響骨骼肌細胞的再生、纖維化以及細胞大小等［8］。但迄今為止，OPN對骨骼肌胰島素抵抗影響的報道并不多見。本研究發現: OPN以劑量和時間依賴方式直接誘導培養的C2C12肌細胞胰島素抵抗，其機制與OPN誘導的內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有關。

材料和方法

1材料與試劑

鼠源OPN蛋白、結晶牛胰島素和抗tubulin抗體購于Sigma;抗蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)抗體、抗磷酸化Akt(p-Akt)抗體、抗葡萄糖轉運體4 (glucose transporter type 4，Glut4)抗體、抗葡萄糖調節蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78)抗體、抗C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)抗體、抗磷酸化肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)抗體、抗胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)抗體和抗磷酸化IRS-1抗體購于CST;抗堿性磷酸酶標記的II抗購自Santa Cruz;內質網應激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，4-PBA)購自Calbiochem;葡萄糖攝取測定試劑盒、抗鈣黏蛋白(cadherin，Cad)抗體、抗CD44抗體、抗c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和磷酸化JNK抗體購于Abcam。

2方法

2.1細胞培養與分化C2C12成肌細胞購于ATCC，常規培養于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)的DMEM中。C2C12肌細胞分化按文獻方法進行［9-10］，基本步驟如下: 100%匯合的C2C12成肌細胞繼續常規培養3 d;采用含1% P/S、0.1% FBS和50 nmol/L胰島素的DMEM誘導分化4 d，然后更換常規培養液培養。1周后，80%～100%的細胞將形成肌管，并用于實驗研究。

2.2葡萄糖攝取的測定采用葡萄糖攝取測定試劑盒測定，具體操作按說明書進行。

2.3蛋白免疫印跡實驗蛋白的提取與定量按本實驗室以前報告的方法進行［10］。蛋白定量后的細胞裂解液與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸變性蛋白，14 000×g離心1 min，取上清行SDSPAGE。蛋白免疫印跡的基本流程如下:恒壓100 V電泳，恒壓100 V、140 min、4℃電轉移蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，1%牛血清白蛋白封閉1 h，Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)顯色，Image-Pro Plus軟件分析結果。

3統計學處理

數據均采用均數±標準差(Mean±SD)表示。組間比較計量數據資料按student t檢驗，計數數據按x2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。所有實驗至少重復3次以上。

結果

1骨橋蛋白以劑量依賴和時間依賴形式誘導C2C12肌細胞胰島素抵抗

為觀察OPN對骨骼肌細胞胰島素抵抗的劑量影響，C2C12肌細胞經無血清處理4 h，然后接受0.1、1、10 mg/L的OPN處理12 h，最后用10 nmol/L胰島素處理10 min。1 mg/L和10 mg/L濃度的OPN可有效抑制胰島素刺激的Akt在Thr308位點的磷酸化，表明該濃度的OPN可導致胰島素抵抗。為觀察OPN誘導胰島素抵抗的時間效應，無血清處理的C2C12肌細胞分別接受1 mg/L OPN處理6 h、12 h、18 h，最后用10 nmol/L胰島素處理10 min。結果表明:處理12 h以上可顯著降低胰島素刺激的Akt在Thr308位點的磷酸化。為觀察OPN對葡萄糖攝取的影響，C2C12肌細胞經無血清處理4 h，然后接受1 mg/L OPN處理12 h，10 nmol/L胰島素處理10 min，結果發現: OPN可降低Glut4向質膜的位移，并抑制胰島素對葡萄糖的轉移。這一結果表明OPN處理可降低C2C12肌細胞對胰島素作用的敏感性，見圖1。

2 CD44抗體可逆轉OPN對胰島素敏感性的影響

OPN通過與跨膜蛋白，如integrin和CD44結合發揮作用［11］，而C2C12細胞主要表達CD44［12］。為進一步確定OPN誘導胰島素抵抗的作用，經無血清處理4 h的C2C12肌細胞，接受10 mg/L抗CD44抗體預處理1 h［13］，然后接受1 mg/L OPN處理12 h，最后用10 nmol/L胰島素處理10 min。CD44抗體處理可以恢復胰島素刺激的Akt磷酸化;同時，經CD44處理的C2C12肌細胞可對抗OPN對Glut4的質膜位移和葡萄糖攝取的不利影響。結果表明: OPN主要經CD44受體蛋白發揮作用，中和其受體蛋白可抵抗OPN誘導的骨骼肌細胞胰島素抵抗，見圖2。

Figure 1.OPN induced insulin resistance in C2C12 myocytes.OPN: osteopontin; INS: insulin; Cad: cadherin.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs INS group.圖1骨橋蛋白誘導C2C12肌細胞胰島素抵抗

3骨橋蛋白可誘導C2C12肌細胞內質網應激

內質網應激在胰島素抵抗的發生中具有重要作用［14］。為研究OPN對內質網應激的可能影響，C2C12肌細胞經無血清處理4 h，然后接受1 mg/L OPN處理12 h。蛋白免疫印跡檢測內質網應激標志蛋白的表達。OPN處理顯著增加內質網應激標志蛋白GRP78、CHOP以及磷酸化的IRE1α的表達。當無血清處理的C2C12肌細胞經10 mg/L抗CD44抗體預處理1 h后，再接受1 mg/L OPN處理12 h，并不能增加上述內質網標志物的表達。這些結果提示: OPN可通過與CD44的結合誘導C2C12骨骼肌細胞的內質網應激，見圖3。

4抑制內質網應激可減輕骨橋蛋白誘導的C2C12肌細胞胰島素抵抗

為闡明內質網應激在OPN誘導C2C12肌細胞胰島素抵抗中的介導作用，C2C12肌細胞經無血清處理4 h，然后同時接受1 mg/L的OPN和3 mmol/L的內質網應激抑制劑4-PBA處理12 h，以及10 nmol/L的胰島素處理10min。結果發現，OPN可增加JNK和IRS-1絲氨酸307位點的磷酸化，而4-PBA處理可顯著降低JNK和IRS-1絲氨酸307位點的磷酸化。此外，結果還顯示: 4-PBA處理可逆轉OPN所致的Akt在Thr308位點磷酸化的降低和IRS-1在絲氨酸307位點磷酸化的增加、Glut4膜位移減少以及葡萄糖攝取量的降低。結果提示內質網應激介導了OPN誘導的C2C12肌細胞胰島素抵抗，見圖4。

Figure 2.OPN-induced insulin resistance in C2C12 myocytes was prevented by neutralization with anti-CD44 antibody.OPN: osteopontin; Ab: antibody; INS: insulin.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs INS group;##P＜0.01 vs OPN plus INS group.圖2中和骨橋蛋白受體CD44可逆轉其誘導的肌細胞胰島素抵抗

討論

OPN在胰島素抵抗和糖尿病中的作用已有文獻報道。OPN的高表達與胰島素抵抗、糖尿病的發生發展密切相關，敲除或中和OPN可以起到降低系統胰島素抵抗、降低血糖、改善糖尿病相關并發癥的作用［4-6］，并認為其機制與炎癥反應等有關［2-3］。本研究的結果發現:骨橋蛋白以劑量依賴和時間依賴方式誘導C2C12肌細胞胰島素抵抗，而且這一作用可被中和肌細胞上OPN受體CD44的抗體逆轉。這一結果表明OPN可直接誘導肌細胞胰島素抵抗的發生，這為OPN誘導胰島素抵抗的機制提供了新的實驗依據和理論解釋。

胰島素是由胰腺β細胞分泌的具有調節血糖作用的重要激素。胰島素通過與其在細胞膜上的胰島素受體結合而激活IRS-1/PI3K/Akt信號通路，使葡萄糖轉移子4從胞漿向細胞膜上位移，葡萄糖借此從細胞外向細胞內轉移，由此起到降低血糖的作用。在這一信號通路上的任何一個信號蛋白分子的含量降低或者功能活性下降均將導致胰島素不能發揮正常的生理功能，即胰島素敏感性降低或胰島素抵抗［15］。導致胰島素抵抗的機制有很多，內質網應激為其中的重要機制之一［14-15］。

Figure 3.OPN induced ER stress in C2C12 myocytes.OPN: osteopontin; Ab: antibody.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs OPN group.圖3骨橋蛋白誘導C2C12肌細胞內質網應激

內質網為蛋白質合成、折疊、修飾的重要場所。當細胞內質網內未折疊或錯誤折疊的蛋白增加時，可導致內質網張力增加(即內質網應激)，并由此引發內質網應激反應(即未折疊蛋白反應)。內質網應激反應可激活JNK的磷酸化，而活化的JNK將導致IRS-1絲氨酸磷酸化的增加、酪氨酸磷酸化的降低，并由此抑制PI3K/Akt信號通路，導致胰島素抵抗的發生［14］。本研究結果發現: OPN可誘導C2C12肌細胞的內質網應激，并促進JNK磷酸化。而內質網應激抑制劑4-PBA可降低OPN所增加的JNK磷酸化，降低IRS-1絲氨酸位點的磷酸化，恢復胰島素刺激所致的Akt磷酸化、Glut4的膜位移以及葡萄糖攝取。因此，有理由認為OPN誘導的肌細胞胰島素抵抗通

過內質網應激介導。

Figure 4.ER stress inhibitor attenuated OPN-induced insulin resistance in C2C12 myocytes.OPN: osteopontin; INS: insulin.Mean ±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs INS group;##P＜0.01 vs OPN plus INS group.圖4內質網應激抑制劑減輕骨橋蛋白誘導的C2C12肌細胞胰島素抵抗

總之，本研究結果表明OPN通過內質網應激誘導肌細胞胰島素抵抗。該研究結果加深了對OPN在肥胖、胰島素抵抗以及糖尿病中作用的認識，為抗糖尿病治療提供了新的作用靶點。

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通訊作者△Tel: 027-68759846; E-mail: chwang0525@ wuh.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.30770758/H0178)

［收稿日期］2014-12-25

［文章編號］1000-4718(2015)06-1075-06

［中圖分類號］R363.2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.019