組蛋白去乙酰化酶抑制劑羅米地辛對小鼠T細胞表型及功能的影響

田孝軍，徐　晶，蔣繼貧(荊州市第二人民醫院重癥醫學科，湖北荊州44000;華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院手術室，器官移植研究所，湖北，武漢4000)

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組蛋白去乙酰化酶抑制劑羅米地辛對小鼠T細胞表型及功能的影響

田孝軍1，徐晶2，蔣繼貧3△
(1荊州市第二人民醫院重癥醫學科，湖北荊州434000;華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院2手術室，3器官移植研究所，湖北，武漢430030)

［摘要］目的:通過體外實驗觀察羅米地辛對效應T細胞和調節性T細胞的作用。方法:取CFSE標記的淋巴細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞作為反應細胞，實驗組加入不同濃度梯度(1、3、5 μmol/L)的羅米地辛及CD3/CD28單抗進行淋巴細胞培養，以僅加入CD3/CD28單抗作為陽性對照組，另設空白對照組。培養72 h后檢測各組細胞的增殖情況。以淋巴細胞作為反應細胞，實驗組、陽性對照組及空白對照組設定同上，72 h后檢測各組中CD4+Foxp3+T細胞與CD4+T細胞的比例變化。同時采用ELISA檢測培養液中相關細胞因子，如TNF-α、IL-10 及TGF-β水平的變化。結果:羅米地辛劑量依賴性地抑制CD3/CD28單抗誘導的淋巴細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖(P＜0.05)。在CD3/CD28單抗存在的條件下，1 μmol/L的羅米地辛不能誘導CD4+Foxp3+T細胞的比例上調(P＞0.05)。但提高羅米地辛的濃度至3 μmol/L和5 μmol/L后，CD4+Foxp3+T細胞的比例顯著提高(P＜0.05)。隨著羅米地辛濃度的增加，TNF-α和IL-10水平呈劑量依賴性降低，但各實驗組明顯高于空白對照組而低于陽性對照組(P＜0.05)。TGF-β在陽性對照組雖稍有升高，但與空白對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。而隨著羅米地辛濃度的增加，TGF-β水平呈劑量依賴性升高，3實驗組間及與空白對照組、陽性對照組間差異顯著(P＜0.05)。結論:體外實驗研究顯示羅米地辛不僅能夠有效抑制效應性T細胞的增殖，而且一定濃度的羅米地辛可上調調節性T細胞的比例，這可能與TGF-β升高有關，而與IL-10變化無關。

［關鍵詞］組蛋白去乙酰化酶;羅米地辛;調節性T細胞

Influence of histone deacetylase inhibitor romidepsin on phenotype and function of T lymphocytes in vitro

TIAN Xiao-jun1，XU Jing2，JIANG Ji-pin3
(1Intensive Care Unit，The Second Hospital of Jingzhou，Jingzhou 434000，China;2Operation Room，3Institute of Organ Transplantation，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Technology＆Science，Wuhan 430030，China.E-mail: 30503249@ qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effects of romidepsin (FK228)，a novel histone deacetylase inhibitor，on the effector and regulatory T cells in vitro.METHODS: As the reactive cells，lymphocytes，CD4+T cells and CD8+T cells were labelled with CFSE，and stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 mAbs in the presence and absence of different levels of romidepsin (experimental group and positive control group)，or PBS (placebo group).After 72 h，the proliferation of the cells was detected in different groups.The lymphocytes were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 mAbs in the presence and absence of different levels of romidepsin (experimental group and positive control group)，or PBS (placebo group).After 72 h，the percentage of CD4+Foxp3+T cells and the levels of related cytokines were detected in different groups.RESULTS: The proliferation of CFSE-labelled lymphocytes，CD4+T cells and CD8+T cells triggered by anti-CD3 and anti-CD28 mAbs all were inhibited when cultured with romidepsin at concentrations of 1 μmol/L，3 μmol/L and 5 μmol/L in a dose-dependent manner (P＜0.05).Compared with placebo group，in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 mAbs，1 μmol/L romidepsin did not increase the percentage of CD4+Foxp3+T cells (P＞0.05).When cultured with romidepsin at concentrations of 3 μmol/L and 5 μmol/L，the percentage of CD4+Foxp3+T cells was enhanced markedly (P＜0.05).The levels of IL-10 and TNF-α in the supernatant were markedly increased in positive control groupand 3 experimental groups (P＜0.05)，and the levels of cytokines in different experimental groups were gradually decreased with the elevation of FK228 concentration (P＜0.05).The level of TGF-β was slightly increased in positive control group with no significant difference compared with placebo group (P＞0.05).With the increase in the concentration of FK228 in different experimental groups，the TGF-β level was increased in a dose-dependent manner and there were significant differences in the 3 experimental groups.Meanwhile，significant differences existed between experimental groups and placebo group and between experimental groups and positive control group (P＜0.05).CONCLUSION: Romidepsin inhibits the proliferation of CD4+and CD8+effector T cells and increases the percentage of CD4+Foxp3+regulatory T cells.It may be related to the increased level of TGF-β，but independent of IL-10.

［KEY WORDS］Histone deacetylase; Romidepsin; Regulatory T cells

組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACi)可逆轉與腫瘤相關的表觀遺傳異常改變，已成為確切的腫瘤治療手段之一［1-2］。近年來，隨著對組蛋白去乙酰化酶研究的深入，進一步發現HDACi對于淋巴細胞還具有較強的免疫抑制作用，其作為潛在的治療自身免疫性疾病和抗移植排斥藥物的可能性逐漸受到重視［3］。已有文獻證實作為HDACi的曲古抑菌素(trichostatin，TSA)和辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)等可影響淋巴細胞的增殖和凋亡等［4］。羅米地辛(romidepsin，FK228)作為新近研發的HDACi已獲得美國FDA批準用于皮膚T-細胞淋巴瘤的治療［5］。但對于其對正常淋巴細胞的影響仍缺乏相關研究。本研究擬在體外小鼠淋巴細胞培養體系中，對其作用加以探討。

材料和方法

1實驗動物

清潔級BALB/c小鼠，6～8周齡，體重約20 g，由華中科技大學同濟醫院器官移植研究所動物中心提供。

2主要試劑及儀器

FITC標記的抗CD4單抗以及APC標記的抗CD8單抗、抗CD3單抗和抗CD28單抗均購于Bio-Legend;羅米地辛購自Celgene;熒光染料CFSE購于Promega; CD4+CD25+Treg流式檢測試劑盒購于eBioscience; CD4+、CD8+T細胞磁珠分離試劑盒購于MACS。流式細胞檢測應用BD FACSCalibur流式細胞儀(BD)。純化的單克隆IL-10抗體、TNF-α抗體、IL-10、TNF-α標準品和生物素標記的Ⅱ抗均購自Phar Mingen;親和素標記的過氧化物酶購自Sigma。

3主要方法

3.1淋巴細胞懸液的制備無菌條件下切取BALB/c小鼠脾臟，超凈工作臺下置于盛有淋巴細胞分離液的培養皿中。以200目尼龍濾網包裹，無齒彎鑷輕輕擠壓至無紅色脾組織塊。收集濾液，加入不完全培養基。以800×g密度梯度離心30 min。收集單個核細胞層。再用不完全RPMI-1640培養液洗滌3次，并調整終濃度至實驗所需(1×1011/L)。臺盼蘭染色判定細胞活力＞95%。

3.2CD4+、CD8+T細胞的分離收集野生型BALB/c小鼠脾細胞懸液(約2×108個)，嚴格按照小鼠CD4亞群、CD8亞群T細胞磁性分選說明書進行陰性分選，得到CD4+或CD8+T細胞。將分離出的細胞250×g離心5 min，棄上清，并重懸細胞，調整細胞濃度為1×1010/L。

3.3 CFSE標記將CFDA-SE原液(10 mmol/L)加PBS稀釋制備成5 μmol/L工作液，37℃與實驗用細胞(淋巴細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞)共孵育10 min。完全RPMI-1640終止，并洗滌細胞1次，經37℃預熱的RPMI-1640重懸標記細胞，再孵育10 min。再次以37℃預熱的RPMI-1640洗細胞1次。調整細胞的濃度為1×1010/L。

3.4羅米地辛對淋巴細胞毒性作用的檢測取按照以上方法獲得的淋巴細胞，每孔加入約106個細胞。羅米地辛溶于以4∶1混合的丙二醇和乙醇溶液中，初始濃度為5 g/L。再以DMSO稀釋至100 mg/L，并于－20°C儲存。根據實驗所需，分別調整羅米地辛的培養體系終濃度為1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L。體系為2 mL。在37℃、5% CO2培養箱孵育72 h。72 h后，收集細胞使用AnnexinⅤ與PI雙染，流式細胞儀檢測，并分析結果。

3.5淋巴細胞增殖的檢測取CFSE標記的淋巴細胞、CD4+T細胞或CD8+T細胞。將上述細胞加入72孔培養板中，每孔加5×105個細胞(200 μL)。加入濃度依次為1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L到羅米地辛。同時以加入1 mg/L的抗CD3/CD28單抗作為實驗組;以僅加入抗CD3/CD28單抗刺激的作為陽性對照組;以PBS代替抗CD3/CD28單抗作為空白對照組。上述各組均培養72 h，每組均設3個復孔。流式細胞儀檢測標記細胞CFSE熒光強度變化。ModFit LT軟件擬合，得到增殖細胞各代的百分率，CellQuest軟件分析增殖細胞比例。

3.6調節性T細胞(Treg)及細胞因子水平的檢測

取未以CFSE標記的淋巴細胞，加入72孔培養板中，每孔5×105個細胞。分別以終濃度1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L的羅米地辛加入1 mg/L的抗CD3/CD28單抗作為實驗組;以僅加入抗CD3/CD28單抗刺激的作為陽性對照組;以PBS代替抗CD3/CD28單抗作為空白對照組。上述各組均培養72 h，每組均設12個復孔，其中3個行Treg細胞檢測，3個行IL-10檢測，3個行TGF-β檢測，3個行TNF-α檢測。另外，(1)取上述每孔細胞，調整至100 μL體系并加入FITC-CD4單抗、APC-CD25單抗各0.5 μL，4℃避光孵育15 min，PBS清洗;加入Foxp3 Fix/Perm Buffer固定，室溫避光反應30 min后，離心棄上清，PBS液洗1次。細胞再以Foxp3 Fix/Perm Buffer打孔后加入1 μL的PE-Foxp3單抗，室溫避光反應30 min; PBS洗并重懸細胞，調整終體積至500 μL。流式細胞術檢測各組細胞的Foxp3表達。(2)取上述每孔上清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法分別檢測IL-10、TGF-β及TNF-α水平。IL-10、TGF-β或TNF-α單抗包板、封閉、上樣。結合生物素化抗體，親和素(酶)與生物素結合，底物顯色。Clinibio全自動酶標儀492 nm波長讀各孔A值，獲得標準曲線和樣本濃度。

4統計學處理

用SPSS 21.0軟件進行統計分析，采用方差分析檢驗各組間差異，組間比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結果

1羅米地辛對淋巴細胞毒性作用的檢測

淋巴細胞在經過羅米地辛孵育72 h后，通過檢測AnnexinⅤ與PI雙陽性細胞比例，查看藥物毒性。通過至少3次獨立實驗，經過統計學分析，各組之間壞死細胞比例差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.The toxicity of FK228 on lymphocytes growth in vitro.Mean±SD.n=3.圖1體外實驗中羅米地辛對淋巴細胞的毒性

2淋巴細胞增殖的檢測

細胞培養72 h后，空白對照組淋巴細胞未見CFSE增殖峰;而陽性對照組中標記細胞在抗CD3/CD28單抗作用下，出現多個CFSE增殖峰;在分別加入1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L羅米地辛后，細胞增殖代數均出現遞減現象，其中以5 μmol/L羅米地辛組的抑制作用最為明顯，未出現明顯增殖峰;分別給予1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L的羅米地辛后，淋巴細胞增殖的抑制率分別為39.7%、79.2%和97.6%。同樣，分別給予1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L的羅米地辛也能明顯抑制實驗組效應性CD4+、CD8+T細胞的增殖(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The effects of different concentrations of romidepsin (FK228) on the proliferation of lymphocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs postive control.圖2羅米地辛對淋巴細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖的影響

3流式細胞儀檢測Treg細胞

淋巴細胞僅受CD3/CD28刺激72 h后，陽性對照組中CD4+Foxp3+T細胞占淋巴細胞的比例與空白對照組相比并無明顯差異;實驗組中加入1 μmol/L羅米地辛后，CD4+Foxp3+T細胞的比例并未明顯提高，與空白對照組和陽性對照組相比差異均無統計學意義;然而給予3 μmol/L和5 μmol/L羅米地辛作用后，CD4+Foxp3+T細胞占淋巴細胞的比例明顯升高，分別達到2.93%和8.14%，與空白對照組、陽性對照組及1 μmol/L羅米地辛作用的實驗組比較，差異顯著(P＜0.05) ;通過流式軟件分析，我們發現Foxp3+T細胞主要位于CD4+CD25+T細胞亞群，占80%以上，見圖3。

4細胞因子TNF-α、IL-10及TGF-β水平的檢測

淋巴細胞受CD3/CD28刺激72 h后，細胞因子TNF-α和IL-10的水平變化陽性對照組較空白對照組均明顯升高(P＜0.05;而不同實驗組中隨著羅米地辛濃度的增加，TNF-α和IL-10水平呈劑量依賴性降低，但各實驗組TNF-α和IL-10水平明顯高于空白對照組而低于陽性對照，組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。而對于TGF-β檢測顯示，陽性對照組雖稍有升高，但與空白對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，而不同實驗組中隨著羅米地辛濃度的增加，TGF-β水平呈劑量依賴性升高(P＜0.05)，見圖4。

討論

HDACi是一類具有抗腫瘤活性的新型藥物。自20世紀90年代以來，越來越多的HDACi被發現。根據分子結構不同，HDACi主要分為短鏈脂肪酸類(丁酸鈉和丙戊酸)、有機氧肟酸類(TSA和SAHA)、苯甲酰胺類(CI-994和MS-27-275)、環狀四肽類(trapoxin A )和雙環肽類(羅米地辛和FR901228)［6］。羅米地辛最早由紫色素桿菌的肉湯培養基中分離得到，同其它HDACi一樣，羅米地辛在成人惡性腫瘤中可誘導細胞周期阻滯、促進細胞分化和凋亡以及改變基因的表達，其已被FDA批準用于復發或難治的皮膚T細胞淋巴瘤(CTCLs)的治療，患者的應答率達50%［7］。但其對正常免疫系統，尤其是淋巴細胞的作用仍知之甚少。

有文獻報告曲古抑菌素A(trichostatin，TSA)通過腹腔給藥方式作用于小鼠后，對CD4+T細胞亞群具有選擇性抑制作用，并且能抑制混合淋巴細胞培養中T細胞的增殖和IL-2的表達［8］。盡管羅米地辛與TSA的作用途徑相同，但其在抑制增殖的效應方面是后者的10倍［9］。在本實驗中，我們以抗CD3單抗聯合抗CD28單抗模擬同種異基因抗原刺激，在淋巴細胞培養體系中，可使后者發生明顯增殖，表現為CFSE標記細胞出現多個子代分裂峰。而當在細胞培養體系中加入不同濃度的羅米地辛后，細胞的增殖受到不同程度抑制。1 μmol/L羅米地辛即表現出顯著的淋巴細胞增殖抑制效應，抑制率為39.7%，細胞增殖各子代的百分率亦明顯降低。而且，隨著藥物濃度的提高，抑制作用逐漸增強，細胞增殖代數遞減，細胞增殖抑制率逐漸提高。同樣地，羅米地辛可以劑量依賴性地抑制CD3/CD28誘導的效應性CD4+和CD8+T細胞的增殖，隨著劑量的增加，增殖抑制逐步增強。上述結果表明，羅米地辛能夠顯著抑制效應T細胞的增殖，進而下調T細胞介導的細胞免疫應答。同時，我們對羅米地辛對淋巴細胞毒性的檢測結果也表明，1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L羅米地辛均不會對淋巴細胞產生明顯的毒性作用。

Figure 3.The changes of CD4+Foxp3+Treg proportion in the lymphocytes cultured in vitro detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3，*P＜0.05 vs positive control group.圖3流式細胞儀檢測體外淋巴細胞培養中CD4+Foxp3+Treg的比例

已有的資料已經顯現HDACi對調節性T細胞的產生以及其發揮免疫抑制功能具有一定的作用［10］。在本研究中，我們將淋巴細胞進行體外誘導，觀察羅米地辛對Treg細胞表達的影響。在抗CD3/CD28單抗存在的情況下，培養體系中加入1 μmol/L羅米地辛并不能誘導CD4+Foxp3+T細胞比例的升高。但是給予3 μmol/L和5 μmol/L羅米地辛后，CD4+Foxp3+T細胞的比例顯著增高，且此種作用亦呈現劑量依賴性。此外，流式分析顯示CD4+CD25+T細胞中Foxp3表達率在80%以上。此結果表明，一定濃度的羅米地辛能夠誘導CD4+CD25+Foxp3+Treg亞群的擴增。

效應型T細胞與調節型T細胞的力量對比決定了同種異基因免疫應答的結局。羅米地辛在對T細胞亞群的作用方面即顯示了雙重性，其不僅能夠抑制效應性T細胞的增殖，而且能夠上調調節性T細胞的比例，從而改變效應性T細胞和與調節性T細胞間的平衡，促使免疫應答向著有利于耐受形成的方向發展。

為了探討在羅米地辛抑制效應T細胞增殖及促進調節性T細胞分化過程中，細胞因子是否發揮了決定性作用，我們還進一步檢測了相關細胞因子水平的變化。一般認為，TNF-α屬于促炎細胞因子，在促進免疫應答過程中發揮主要作用;而IL-10和TGF-β屬于抗炎細胞因子，在抑制免疫應答過程中發揮主要作用［11］。本研究結果表明，TNF-α在各組中的變化規律與效應T細胞活化增殖及受抑制的變化規律完全一致。同樣，TGF-β在空白組與陽性對照組并無明顯差異，而隨著羅米地辛對效應T細胞抑制作用的加強，其水平也有顯著升高，這與CD4+CD25+Foxp3+Treg比例變化的規律也一致。既往已證實TGF-β可以促進CD4+T細胞高表達Foxp3進而產生抑制性表型;同時CD4+CD25+Foxp3+Treg也可受TCR刺激，通過分泌TGF-β和IL-10而發揮免疫抑制作用。本研究的結果提示伴隨著效應性T細胞的增殖，有一定水平的TGF-β升高。而這種TGF-β升高又可以隨著羅米地辛對效應T細胞的抑制，而導致效應性T細胞高表達Foxp3，從而分化為CD4+CD25+Foxp3+Treg。同樣，隨著CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的升高，又可以分泌更多的TGF-β，從而進一步增強了CD4+CD25+Foxp3+Treg的免疫抑制功能以及提高了比例。然而，對于IL-10檢測的結果顯示隨著效應T細胞的增殖，其水平顯著升高，而隨著羅米地辛對效應T細胞抑制作用的加強，其水平并未升高。相反，卻呈進行性下降。此結果表明，羅米地辛所誘導的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例升高，是非IL-10依賴性的。

Figure 4.The changes of IL-10，TNF-α and TGF-β in different groups by ELISA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs placebo group;#P＜0.05 vs positive control group.圖4 ELISA檢測各組上清液中TNF-α、IL-10及TGF-β水平

目前對于HDACi在調節免疫系統方面的作用仍不夠深入，下一步的研究將著重于探討何種類型的HDACi對淋巴細胞的作用最佳，具體的作用方式如何?以及使用何種濃度HDACi可以在抑制效應性T細胞的增殖的同時，使體內調節性T細胞達到穩定、持續的表達。

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·短篇論著·

通訊作者△Tel: 027-83665283; E-mail: 30503249@ qq.com

［收稿日期］2014-07-09［修回日期］2015-04-28

［文章編號］1000-4718(2015)06-1099-06

［中圖分類號］R392.1

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.023