腦缺血及后適應對樹鼩海馬內質網應激信號分子PERK及GRP78的影響*

陳理軍，馬　艷，李　霞，陳　靜，李樹清，張　穎△(昆明醫科大學病理生理學教研室，云南昆明　65003;紅河衛生職業學院，云南蒙自6600)

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腦缺血及后適應對樹鼩海馬內質網應激信號分子PERK及GRP78的影響*

陳理軍1，馬艷2，李霞1，陳靜1，李樹清1，張穎1△
(1昆明醫科大學病理生理學教研室，云南昆明650031;2紅河衛生職業學院，云南蒙自661100)

［摘要］目的:探討腦缺血及后適應對樹鼩海馬內質網應激信號分子蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)及葡萄糖調節蛋白78(GRP78)的影響及后適應的腦保護機制。方法:光化學反應誘導樹鼩局部血栓性腦缺血，于腦缺血后3.5 h夾閉、打開缺血側頸總動脈交替3個循環(每次5 min)以復制缺血后適應模型。HE染色觀察缺血側海馬神經元損傷及超微結構變化，RT-PCR檢測腦缺血及后適應不同時間海馬組織PERK及GRP78 mRNA表達的變化，免疫組織化學法與Western blot法檢測PERK及GRP78的蛋白定位及表達變化。結果:海馬神經元隨腦缺血時間延長而損傷加重，缺血24 h損傷最為嚴重，后適應可減輕損傷。腦缺血4 h、24 h及72 h PERK的mRNA及蛋白表達較假手術組增高(P＜0.05)，后適應組與相應的缺血組相比，PERK的mRNA及蛋白表達減少，4 h、24 h差異顯著(P＜0.05) ;腦缺血4 h、24 h及72 h GRP78的mRNA及蛋白表達與假手術組無明顯差異，后適應24 h組較缺血24 h組表達增高(P＜0.05)。結論:樹鼩局部血栓性腦缺血可激活缺血側海馬內質網應激反應，引起PERK/eIF2α信號轉導通路中相關分子PERK的mRNA及蛋白表達增高。缺血后適應處理通過下調PERK、上調GRP78的表達，減輕內質網應激反應，減少神經元損傷，具有一定的腦保護作用。

［關鍵詞］蛋白激酶R樣內質網激酶;葡萄糖調節蛋白78;缺血后適應;內質網應激;海馬;光化學反應;樹鼩

［修回日期］2015-04-16

Effects of cerebral ischemia and postconditioning on signaling molecules PERK and GRP78 in hippocampus tissue of tree shrew during endoplasmic reticulum stress

CHEN Li-jun1，MA Yan2，LI Xia1，CHEN Jing1，LI Shu-qing1，ZHANG Ying1
(1Department of Pathophysiology，Kunming Medical University，Kunming 650031，China;2Honghe Vocational Health College，Mengzi 661100，China.E-mail: coco90305@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of cerebral ischemia and postconditioning on protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) in the hippocampus tissue of tree shrew during endoplasmic reticulum stress and the mechanism of post-conditioning protecting the brain from damage.METHODS: The focal cerebral ischemic model was duplicated by photochemical reaction in tree shrew and the postconditioning was induced by alternatively occluding and opening the carotid artery of ischemic side for 3 cycles (5 min each cycle) at 3.5 h after ischemia.The damage and ultrastructural changes of the hippocampal neurons were observed by HE staining.The expression of PERK and GRP78 at mRNA and protein levels in the hippocampal tissue at different time points after cerebral ischemia and postconditioning was determined by RT-PCR，immunohistochemistry and Western blot.RESULTS: The injuries of hippocampal neurons were aggravated with prolonged cerebral ischemia，which was most severe at 24 h after ischemia while the postconditioning alleviated these damages correspondingly.The expression of PERK at mRNA and protein levels was upregulated at 4 h，24 h and 72 h after ischemia (P＜0.05)，while postconditioning downregulated the expressions of PERK at ischemia and postconditioning 4 h (IP4 h) gruop and IP24 h group (P＜0.05).The expression of GRP78 at mRNA and protein levels was not changed at 4 h，24 h and 72 h after ischemia，while postconditioning upregu-lated the expressions of GRP78 at IP24 h group (P＜0.05).CONCLUSION: The focal thrombotic cerebral ischemia activates the endoplasmic reticulum stress in ischemic hippocampus of tree shrews，leading to the changes in mRNA and protein expression of PERK in the PERK/eIF2α signal transduction pathway.The postconditioning treatment alleviates endoplasmic reticulum stress and neuronal damages by downregulating PERK and upregulating GRP78，thereby protecting the brain from injury.

［KEY WORDS］Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase; Glucose-regulated protein 78; Ischemic postconditioning; Endoplasmic reticulum stress; Hippocampus; Photochemical reaction; Tree shrew

近年來有關內質網研究表明內質網不僅維持細胞的生存，而且參與了細胞凋亡的調控。缺血性腦損傷可誘導內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)［1］，適度而短暫的ERS對細胞具有保護作用，嚴重而長時間的ERS將導致細胞損傷。有研究報道［1］大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠，隨著缺血時程延長，皮層熱休克蛋70(heat shock protein 70，HSP70)及激活轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF-4)等ERS標志蛋白表達增多，而使用真核翻譯起始因子2α (eucaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)特異拮抗劑后，上述蛋白及mRNA的表達相應減少，表明腦缺血可激活ERS的蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)/eIF2α通路。另有研究［2］發現大鼠經中腦動脈閉塞缺血再灌后腦梗塞面積增大，ERS的標志蛋白葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)及CHOP表達增加，且凋亡因子caspase-12平行出現在TUNEL染色陽性細胞中，證實腦缺血激活ERS所致的腦損傷可能與凋亡有關。我室前期研究也發現樹鼩腦缺血可致內質網應激及內質網擴張，加重神經元損傷，但具體的發生機制尚不清楚。

由此可見，腦缺血再灌注引起的ERS可加重神經元繼發性損傷，如何有效阻斷ERS，而起到一定的腦保護作用?腦缺血后適應(postconditioning，Post-C)是指在腦缺血再灌注后一定時間內，給予數次短暫性缺血-再灌注，激活組織內源性保護機制，增強腦組織缺血耐受性，減少神經元繼發性損傷［3］。Post-C是否可通過干預內質網應激，阻斷內質網應激時信號轉導通路，而起到相應的腦保護作用?基于此假設，本研究通過觀察腦缺血及后適應對海馬內質網應激關鍵的信號分子PERK及GRP78表達的影響，部分闡釋腦缺血激活的內質網應激引起的腦損傷及Post-C干預ERS所起到的腦保護作用的機制。

材料和方法

1材料

1.1動物健康成年樹鼩126只，雌雄不限，體重(100±20) g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，實驗前避光、清潔、安靜環境下單籠飼養，將動物隨機分為假手術(sham)組、缺血(ischemic，I) 4 h(I4 h)組、缺血后適應4 h(IP4 h)組、缺血24 h(I24 h)組、缺血后適應24 h(IP24 h)組、缺血72 h(I72 h)組、缺血后適應72 h(IP72 h)組，共計7個組。實驗動物術前及術后自由攝食攝水。

1.2儀器本室自行研制的SQ-Ⅲ型局部腦血栓形成裝置，大體由光源(含濾波電路及觸發器)、萬能支架、數控光源及散熱裝置組成。光學系統組成包括干涉濾片及聚光透鏡。光源中心波長(λ=560 nm)，帶寬(Δλ=60 nm)，光強度(1×104W/m2)，用時間繼電器控制照射時間。

1.3主要試劑硫噴妥鈉為上海新亞藥業有限公司產品;山羊血清封閉液購自北京博奧森生物技術有限公司; DAB顯色試劑盒、Ⅱ抗Max-VisionTM即用型試劑購自福州邁新生物技術開發有限公司;Ⅰ抗PERK、GRP78購自Santa Cruz;β-actin購自Abcam; HRP標記羊抗兔、羊抗鼠Ⅱ抗購自KPL; PERK、GRP78、β-actin引物由生工生物工程股份有限公司合成; cDNA Synthesis Kit、PCR Master Mix購自Thermo。

2主要方法

2.1使用腦血栓形成裝置建立樹鼩局部血栓性腦缺血模型［4］以1%硫噴妥鈉(5 mL/kg)腹腔注射麻醉動物，待動物麻醉將其固定，經舌下靜脈一次性注射(1.5 g/L)孟加拉紅生理鹽水溶液(1.33 mL/kg)，待循環10 min后，用碘伏、75%的乙醇依次消毒右側頭部皮膚，于右側頭頂部備皮，自右耳屏前至右眼外眥作切口，分離部分顳肌以暴露頂區顱骨，將動物置于SQ-Ⅲ型局部腦血栓形成裝置下，使光束聚焦直射顱骨表面，在光強度為1×104W/m2下照射血管15 min(時間由繼電器控制)，照射期間維持顱骨表面溫度于(36±1)℃。常規消毒并逐層縫合切口，放入飼養籠，保持體溫。

2.2缺血后適應模型的建立在光化學法局部血栓性腦缺血模型復制成功后，在缺血4 h的時間點前40 min，用1%硫噴妥鈉(2.5 mL/kg)麻醉動物，動物仰臥固定后，常規消毒頸部，作縱形正中切，切開皮膚、皮下組織及頸闊肌，在右側胸鎖乳突肌的前緣分離出頸動脈鞘，并確保迷走神經和頸內靜脈得到保護，分離頸總動脈，穿線，在缺血4 h時點前30 min用無創動脈夾在甲狀軟骨平面夾閉頸總動脈5 min后，去掉動脈夾再灌注5 min，夾閉-開夾共計重復3個循環，用時30 min以復制缺血后適應模型。術后縫合動物頸部創口，放入飼養籠，保持體溫。

2.3 HE染色樣品從冰箱取出平衡至室溫，蠟塊標本連續切片，切片厚約4 μm，貼片，并移至55℃恒溫箱內烤片4～6 h，切片在二甲苯中室溫脫蠟10 min，移入二甲苯和純乙醇(1∶1)混合液中5 min，入梯度下行乙醇，后經蒸餾水水化并轉入染液，蘇木精染液染色10 min，沖洗多余的染液，1%鹽酸乙醇(70%乙醇配制)分化數秒(鏡檢控制，直至細胞核及核內染色質清晰為止)，沖洗20 min，或在碳酸鋰飽和溶液中短時間堿化使細胞核呈藍色，蒸餾水漂洗5 min(換2次水)，0.5%伊紅染液染色1～5 min，梯度上行乙醇脫水(2次)，因為在95%以下的乙醇中伊紅易脫色，所以采用二甲苯透明(2次)，共約10 min。封片:擦去切片周圍多余的二甲苯，待二甲苯未干之前，迅速滴加適量中性樹膠，加蓋玻片封片。

2.4免疫組織化學法檢測PERK、GRP78冰箱內取出蠟塊標本平衡至室溫，蠟塊標本連續切片，切片厚度4 μm，并移至55℃恒溫烤箱內烤片4～6 h，待切片周圍的石蠟溶化，且保持濕潤狀態時即可停止烤片;組織切片脫蠟，置于二甲苯中室溫孵育3次，每次10 min，將切片置于100%乙醇溶液內洗片2次，每次10 min，再將切片置于梯度下行乙醇溶液內洗片1次，每次5 min;最后將切片移入去離子水內5 min再水化;將切片置于1 mmol/L EDTA(pH 8.0)內煮沸15 min，進行抗原修復，自然冷卻至40℃后用去離子水洗片3次，每次5 min，之后用含Triton X-100的PBS(PBS-TX)洗片3次，每次10 min，3% H2O2+ PBS(pH 7.4)溶液孵育去除內源性過氧化物酶;切片用0.05 mol/L PBS-TX緩沖液(pH 7.4)洗3次，每次10 min;然后用5%的山羊血清封閉60 min，甩去血清后直接加入GRP78、PERK(1∶100) I抗4℃下孵育過夜;第2天用PBS洗3次，每次10 min;加入II抗(鼠/兔)，室溫下孵育30 min;用PBS洗3次，每次10 min;除去PBS液，加入新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5 min;自來水沖洗，蘇木素復染，用0.1% HCl分化，自來水沖洗至返藍;切片經梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。對照組以PBS代替Ⅰ抗進行孵育，其余步驟一致。染色結果在光學顯微鏡下進行觀察，制作好的切片干燥避光儲存。

2.5 RT-PCR檢測PERK和GRP78的mRNA表達于對照組、腦缺血后不同時點、缺血后適應后不同時點麻醉動物，迅速斷頭經高壓蒸汽滅菌處理取缺血側海馬，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，測定RNA樣品的純度和含量，逆轉錄反應合成cDNA，以cDNA為模版，按25 μL的體系進行RT-PCR(各基因擴增的退火溫度如下: PERK 42.5℃; GRP78 47.5 ℃;β-actin 52.5℃)，瓊脂糖凝膠電泳，電泳后取出凝膠，在紫外線下觀察，可見桔黃色條帶，用凝膠電泳成像儀系統采集圖像。引物見表1。

表1　 PERK、GRP78與β-actin的引物序列Table 1.Primer sequences of PERK and GRP78

2.6 Western blot檢測PERK和GRP78的蛋白水平

于對照組、腦缺血后不同時點、缺血后適應后不同時點麻醉動物，迅速斷頭在冰面上經消毒取缺血側海馬，按組織重量每100 mg組織加入1 mL裂解液提取總蛋白，Bradford法測定蛋白質濃度，進行SDSPAGE，電泳后半干轉到PVDF膜，用保鮮膜將PVDF膜封起來，5%脫脂牛奶封閉，室溫振搖封閉2 h，將PERK、GRP78抗兔多克隆抗體(1∶800)和β-actin抗鼠多克隆抗體(1∶20 000)用含0.1% Tween-20 TBS封閉液稀釋后分別加入，室溫振搖2 h后，4℃冰箱中孵育過夜，用含0.05% Tween-20的TBST洗膜3次，依次為30 min、20 min、10 min，將辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗用含0.1% Tween-20 TBS封閉液稀釋后分別加入，室溫振搖2 h，用含0.05% Tween-20的TBS洗膜3次，依次為30 min、20 min、10 min。ECL化學發光處理6 min后(PERK、GRP78)或1 min后(β-actin)，采用化學發光凝膠成像儀檢測目的條帶。

3統計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 5統計軟件行方差齊性檢驗、單因素方差分析，樣本均數間的兩兩比較用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 HE染色結果

假手術組海馬結構完整、層次清晰、分布均勻，海馬神經元細胞的形態結構未出現異常，CA1區的錐體細胞形態正常，細胞核大而且呈圓形，核仁較明顯。缺血4 h組可見缺血性改變;隨缺血時間延長，海馬神經元細胞損傷加重，缺血24 h組的病變最為明顯，此時缺血側海馬CA1區錐體細胞的胞體縮小，胞漿尼氏小體消失，呈嗜酸性變，細胞核固縮，核仁消失，結構紊亂，細胞周圍形成空泡，神經元密度急劇減少。缺血72 h組海馬病變有所減緩，但仍有部分神經元細胞固縮。后適應4 h組可見神經元嗜酸性變有所減輕，而后適應24 h組海馬神經元損傷有明顯的減輕，后適應72 h組神經元細胞出現層次性增加，見圖1。

Figure 1.The HE staining and expressions of PERK and GRP78 in by immunohistochemistry the hippocampus of tree shrew during cerebral ischemia and post-conditioning.圖1腦缺血及后適應缺血側海馬組織HE染色及PERK與GRP78免疫組化結果

2免疫組織化學染色結果

光學顯微鏡下觀察，陽性反應部位呈現棕黃色(DAB顯色)。假手術組海馬PERK蛋白散在而且低水平表達，I4 h、I24 h及I72 h組缺血側海馬PERK的表達增強，以I4 h最為明顯。后適應與相應缺血組對比，PERK蛋白表達減少，IP24 h組減少最為顯著;假手術組海馬GRP78蛋白散在而且低水平表達，I4 h、I24 h及I72 h樹鼩海馬GRP78的表達略增強。后適應組與缺血組相比，IP24 h組表達增強，見圖1。

3腦缺血及后適應對缺血側海馬組織PERK、GRP78 mRNA表達的影響

局部血栓性腦缺血I4 h組、I24 h組及I72 h組缺血側海馬組織PERK的mRNA表達較假手術組明顯增強(P＜0.05)。后適應組與缺血組比較，IP4 h組、IP24 h組海馬組織PERK的mRNA表達減少(P＜0.05) ;局部血栓性腦缺血I4 h組I24及I72 h組缺血側海馬組織GRP78的mRNA表達較假手術組稍高，但差異不顯著。后適應組與缺血組比較，IP24 h組海馬的GRP78 mRNA表達增強(P＜0.05)，見圖2。

4腦缺血及后適應對缺血側海馬組織PERK、GRP78蛋白表達的影響

局部血栓性腦缺血I4 h組、I24 h組及I72 h組缺血側海馬組織PERK蛋白表達較假手術組明顯增強(P＜0.05)。后適應組與缺血組比較，IP24 h組及IP72 h組海馬PERK蛋白表達減少(P＜0.05) ;局部血栓性腦缺血I4 h組、海馬GRP78蛋白表達較假手術組增強(P＜0.05)。后適應組與缺血組比較，IP24 h組海馬GRP78蛋白表達增強(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of PERK and GRP78 at mRNA and protein levels in ischemic hippocampus of tree shrew during cerebral ischemia and postconditioning.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I4 h;△P＜0.05 vs I24 h.圖2腦缺血及后適應缺血側海馬組織PERK與GRP78 mRNA和蛋白的表達

討論

大量研究表明缺血再灌可加重腦組織的損傷及功能障礙，本實驗主要探討光化學誘導樹鼩局灶性腦缺血是否激活海馬內質網應激PERK/eIF2α信號轉導通路及后適應的干預機制。研究發現隨缺血時間延長，缺血側海馬神經元損傷加重，神經元密度急劇減少，缺血72 h組海馬病變有所減緩，但仍有部分神經元細胞固縮，而同時內質網表現出結構紊亂，內質網池擴張及溶解。這與湯諹等［4］研究一致，表明腦缺血可激活內質網應激，并損傷神經元。

PERK屬于內質網應激PERK/elF2α信號轉導通路的啟動蛋白，通過胞漿內結構域的自身二聚化和磷酸化而激活［5］。有研究發現使用PERK選擇性抑制劑U0126可以加重神經元的死亡，從而推測PERK在內質網應激在缺血性腦損傷中起保護作用［6］。然而近年來的研究更傾向于PERK可加重缺血性腦損傷的觀點，Henriksson等［7］證明U0126抑制PERK激活后可減輕神經元損傷。本研究亦發現，腦缺血后海馬組織PERK表達增強，神經元損傷加重，可能與PERK通路持續性激活引起嚴重的ERS、啟動CHOP誘發凋亡、促使缺血/再灌注損傷加重有關。

GRP78是HSP70家族成員之一，也是一種分子伴侶，在ERS時表達上調，促進新合成的多肽進一步折疊、修飾或與堆積的未折疊蛋白及錯誤折疊的蛋白相結合后通過內質網相關降解反應來實現對未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白降解［8］，在應激狀態下具有維護內質網正常功能及維持細胞內Ca2+平衡的作用［9］。研究表明GRP78作為PERK/eIF2α信號轉導通路的上游相關分子，可抑制腦缺血誘導的內質網應激產生的損傷［10］。本研究發現，腦缺血損傷誘導內質網應激引起GRP78表達升高，可能與GRP78需要去應對缺血引起的內質網應激時大量未折疊或錯誤折疊蛋白質減少內質網損傷有關，表明GRP78具有一定的神經保護作用。

減輕缺血后神經元損傷一直是國內外腦缺血基礎研究和探索的重要領域。Post-C是一種在方法上與缺血預適應完全不同，但作用相似的腦保護措施。海馬神經元是腦缺血或其它毒性物質最易損傷區域［11］，我室前期研究亦發現多次短暫閉塞動物的頸動脈可延長樹鼩腦缺血治療的“時間窗”，缺血后適應可顯著提高缺血24 h、72 h海馬CA1區局部區域血流［12］。本次研究發現，缺血后適應下調PERK、上調GRP78而減輕內質網應激，從而減輕缺血側海馬神經元的損傷。本研究還發現，腦缺血4 h時PERK表達即有改變，4 h是腦缺血病理生理過程的超早期，從形態學角度雖未觀察到神經元改變，而相關信號轉導通路已被激活［2］。如果能在此期間通過缺血后適應處理，激活自身組織細胞內源性保護作用機制，可增強腦組織缺血耐受性，從而減輕繼發性腦損傷。

綜上所述，腦缺血可誘發內質網應激反應，PERK/eIF2α信號轉導通路得以激活，其中的信號分子PERK與GRP78表達發生改變，從而加重神經元繼發性損傷。而缺血后適應可下調PERK、上調GRP78而減輕內質網應激反應，從而起到一定的腦保護作用。

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通訊作者△Tel: 0871-65922858; E-mail: coco90305@126.com

*［基金項目］國家科技支撐計劃(No.2014BAIO1B01) ;國家自然科學基金資助項目(No.31360245) ;云南省應用基礎研究(昆醫聯合專項) (No.2012FB013)

［收稿日期］2014-11-05

［文章編號］1000-4718(2015)06-1105-06

［中圖分類號］363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.024