重組可溶性人CD40L誘導人臍靜脈內皮細胞損傷*

劉紅利，陳　檬，王宏濤，，吳以嶺，，△［南京中醫藥大學，江蘇南京00;河北以嶺醫藥研究院，國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，河北省絡病重點實驗室，河北石家莊05005］

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重組可溶性人CD40L誘導人臍靜脈內皮細胞損傷*

劉紅利1，陳檬2，王宏濤2，3，吳以嶺1，2，4△
［1南京中醫藥大學，江蘇南京210023;2河北以嶺醫藥研究院，3國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，4河北省絡病重點實驗室，河北石家莊050035］

［摘要］目的:探討重組可溶性人CD40L(rshCD40L)對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的損傷作用及其在動脈粥樣硬化中的作用。方法:應用rshCD40L刺激人臍靜脈內皮細胞12 h; MTS法觀察HUVECs的生存活性，ELISA法測內皮細胞E-選擇素(E-selectin)、細胞間黏附分子(ICAM) -1、組織因子(TF)、組織因子途徑抑制物(TFPI)表達的變化，比色法測脂質過氧化物丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。結果:與正常組比較，不同濃度的rshCD40L(0.5、1、2、3 mg/L)對內皮細胞的生存活性無明顯影響; 0.5 mg/L rshCD40L即可增加內皮細胞E-selectin、sICAM-1、TF、TFPI的分泌，差異有統計學意義(P＜0.01)，同時增加內皮細胞MDA的含量、降低SOD活性(P＜0.05)。結論: 0.5～3 mg/L rshCD40L對內皮細胞生存活性無明顯影響，但已經引起內皮細胞功能障礙，增加內皮細胞炎癥和外源性凝血反應，誘導內皮細胞脂質過氧化物損，使其抗氧化能力下降。

［關鍵詞］重組可溶性人CD40L;人臍靜脈內皮細胞;動脈粥樣硬化

［修回日期］2015-03-03

Injury effect of recombinant soluble human CD40 ligand on human umbilical vein endothelial cells

LIU Hong-li1，CHEN Meng2，WANG Hong-tao2，3，WU Yi-ling1，2，4
［1Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China;2Hebei Yiling Medical Research Institute，3Key Research Centre of State Administration of Traditional Chinese Medicine (Collateral Disease of Cardiovasculature)，4Key Laboratory of Collateral Disease of Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China.E-mail: weitcm@163.com］

［ABSTRACT］AIM: To investigate the damage in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by recombinant soluble human CD40 ligand (rshCD40L).METHODS: The cultured HUVECs were treated with rshCD40L for 12 h.The survival activity of the HUVECs was observed by MTS assay.The expression of E-selectin，intercellular adhesion molecule (ICAM) -1，tissue factor (TF) and tissue factor pathway inhibitor (TFPI) was measured by ELISA.The activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of malondialdehyde (MDA) were detected by the methods of thibabituric acid (TBA).RESULTS: Compared with normal group，different concentrations of rshCD40L (0.5，1，2，3 mg/L) had no obvious effect on the survival activity of the HUVECs (P＞0.05).rshCD40L at concentration of 0.5 mg/L promoted the secretion of E-selectin，sICAM-1，TF and TFPI in the HUVECs (P＜0.01).rshCD40L at concentration of 0.5 mg/L also increased MDA content and reduced the activity of SOD in the HUVECs (P＜0.05).CONCLUSION: 0.5～3mg/L rshCD40L has no obvious effect on endothelial cell survival，but already causes endothelial dysfunction by increasing endothelial inflammation and exogenous coagulation reaction，inducing lipid peroxides injury and reducing antioxidant capacity.

［KEY WORDS］Recombinant soluble human CD40 ligand; Human umbilical vein endothelial cells; Atherosclerosis

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病的病理基礎，其發病機制復雜，涉及到炎癥因子、脂質代謝、凝血因素、免疫缺陷和遺傳等多種因素相互作用，其中內皮細胞功能障礙是AS的始動環節并貫穿于全過程［1］。CD40/CD40L屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和腫瘤壞死因子受體超家族，在免疫炎癥網絡反應中起重要的橋梁作用。國外研究學者認為CD40L的持續上調及其促血栓形成和促炎作用是臨床卒中患者慢性期轉歸差的因素之一［2］。在我國，也有研究發現血液中CD40L的單核苷酸多肽性與急性冠脈綜合征的病變程度相關，是其獨立的危險因素之一［3］。本研究采用重組可溶性人CD40L(recombinant soluble human CD40 ligand，rshCD40L)刺激體外培養的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，通過觀察rshCD40L刺激HUVECs后內皮細胞生存活性、炎癥因子、凝血相關因子和氧化損傷的變化來評價rshCD40L對內皮細胞的損傷作用，進一步探討CD40L在AS發病機制中的作用。

材料和方法

1細胞、試劑和儀器

人臍靜脈內皮細胞株(上海中國科學院細胞庫)接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中(內含青霉素1×108U/L，硫酸鏈霉素1×108U/L，慶大霉素5×107U/L)，37℃、5% CO2孵箱傳代培養，待細胞融合至80%時進行分組干預。

rshCD40L(Miltenyi Biotec)以去離子水配成250 mg/L儲備溶液，除菌過濾，－20℃保存備用，使用前以含0.1% BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋到適當濃度。DMEM高糖培養基、MTS試劑(Promega) ; E-選擇素(E-selectin)試劑盒(Ray Bio) ;可溶性細胞間黏附分子(soluble intercellular adhesion molecule，sICAM-1)試劑盒(R＆D) ;組織因子(tissue factor，TF)、組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)試劑盒(Assaypro) ;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

Forma 371細胞CO2培養箱(Thermo Scientific) ;多功能酶標儀(BioTek) ; KA-1000A飛鴿牌離心機(上海安亭科學儀器廠)。

2方法

2.1 MTS法檢測rshCD40L誘導內皮細胞的生存活性取對數生長期的人臍靜脈內皮細胞以1×105接種于96孔培養板內，在上述條件下培養24 h后，更換不含血清的培養基，模型組加入rshCD40L使其終濃度分別為0.5、1、2、3 mg/L，正常組不加rshCD40L干預，每組設4個復孔，繼續貼壁培養12 h。棄去舊培養液，每孔加100 μL MTS孵育1 h，在多功能酶標儀上于570 nm處測定吸光值(A值)。

2.2rshCD40L誘導內皮細胞表達E-selectin、sICAM-1、TF和TFPI對數生長期的人臍靜脈內皮細胞以1×105接種于96孔培養板內，在上述條件下培養24 h后，更換不含血清的培養基，模型組加入rsh-CD40L使其終濃度為0.5 mg/L，正常組不加rsh-CD40L干預，每組4個復孔繼續貼壁培養12 h。收集每孔細胞上清液，嚴格按照各試劑盒說明書進行操作。

2.3比色法測rshCD40L誘導HUVECs MDA和SOD的含量對數生長的人臍靜脈內皮細胞以1× 105接種于6孔培養板內，在上述條件下培養24 h后，更換不含血清的培養基，模型組加入rshCD40L使其終濃度為0.5 mg/L，正常組不加rshCD40L干預，繼續貼壁培養12 h。棄去培養基，5%胰酶消化收集細胞，生理鹽水清洗2遍，超聲破碎，收集細胞裂解液，取2 μL進行蛋白定量，剩余細胞裂解液按試劑盒說明書操作檢測。

3統計學處理

所有實驗數據均采用軟件SPSS 17.0行統計學分析。計量數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 rshCD40L對HUVECs生存活性的影響

與正常組比較，0.5 mg/L的rshCD40L輕微降低內皮細胞的生存活性，但差異無統計學意義。隨著rshCD40L濃度的增加，各組對內皮細胞生存活性的影響與正常組比較及各組間比較均無顯著差異(P＞0.05)，見圖1。后續實驗采用0.5 mg/L濃度刺激內皮細胞。

Figure 1.The effect of rshCD40L at different concentrations on the cell viability of HUVECs.Mean±SD.n=4.圖1 rshCD40L不同濃度組的細胞存活率

2 rshCD40L對HUVECs表達E-selectin、sICAM-1、TF和TFPI的影響

與正常組比較，0.5 mg/L的rshCD40L孵育內皮細胞12 h可刺激內皮細胞培養液中黏附分子E-selectin、sICAM-1表達增加，促進組織因子TF表達，同時降低TFPI水平，差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1　 rshCD40L對內皮細胞不同細胞因子表達的影響Table 1.The effects of rshCD40L on the expression of different cytokines in HUVECs (Mean±SD.n=4)

3 rshCD40L對HUVECs MDA含量和SOD活性的影響

與正常組比較，0.5 mg/L的rshCD40L孵育內皮細胞12 h可顯著升高細胞裂解液中MDA的含量，降低SOD活性，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2　 rshCD40L對內皮細胞MDA含量和SOD活性水平變化的影響Table 2.The effects of rshCD40L on the changes of MDA and SOD in the HUVECs (Mean±SD.n=4)

討論

CD40與CD40L屬于TNF受體/TNF超家族成員，為跨膜糖蛋白，表達于多種與AS相關的細胞表面［4］，如內皮細胞、血小板、巨噬細胞、平滑肌細胞和T細胞等，兩者以配體-受體結合的形式誘導細胞內信號級聯反應發揮生物學效應，促進動脈粥樣硬化相關基因表達，在AS早期內皮細胞功能障礙、粥樣斑塊不穩定性和血栓形成過程中均是重要的參與者［5-6］。其中CD40L主要表達在活化的T淋巴細胞、B細胞和血小板上，血小板活化后，可在數分鐘內將內部儲存的CD40L迅速轉移至膜表面并在蛋白水解酶的作用下從膜表面脫落形成可溶性的CD40L，有研究資料顯示，血液中95%的sCD40L是由血小板活化后釋放的［7］，sCD40L具有CD40L相同的生物學作用。

內皮細胞是血管內膜的屏障，直接受到各種危險因素的刺激而發生功能和結構改變，其功能障礙則是AS發生發展的關鍵環節。正常內皮細胞可表達CD40受體，體內存在或體外給予外源性的可溶性CD40L均能與內皮細胞CD40結合相互作用誘導內皮細胞內信號轉導，激活黏附分子、炎癥因子、趨化因子等的表達，促進單核細胞、淋巴細胞、血小板黏附到血管內皮細胞，形成AS早期炎癥反應并加速斑塊形成［8-9］。有研究表明，CD40L還可通過激活PI3K信號通路增加活性氧的表達［10］;上調內皮細胞表達基質金屬蛋白酶家族，降解斑塊成分，使斑塊易于破裂增加斑塊的不穩定性［11］; CD40/CD40L還可調節內皮細胞的促凝活性，促發血栓形成［12］。本研究結果顯示0.5 mg/L的rshCD40L即可顯著增強內皮細胞表達E-selectin和sICAM-1，與之前的研究結果相符。E-selectin和sICAM-1表達增多加強了炎癥細胞向血管內皮細胞趨化黏附的作用，擴大局部的炎癥反應。TF與TFPI是體內維持凝血系統和纖溶系統平衡的相互制約的一對因子，有研究發現內皮細胞凝血活性增強是AS血栓形成的主要病理基礎［13］。本研究同樣觀察到0.5 mg/L的rshCD40L不僅增加內皮細胞TF表達，促使纖維蛋白原向纖維蛋白轉化，發揮促凝效應，同時還能夠降低凝血因子途徑抑制物(TFPI)的表達，使抗凝功能紊亂。既往研究證實，AS患者和動物模型中均有氧自由基損傷，機體的脂質過氧化物和抗氧化系統穩態失衡，導致體內大量氧自由基蓄積，脂質過氧化反應劇烈，最終引起細胞結構損傷和功能紊亂，細胞凋亡、壞死。MDA是脂質過氧化產物，其含量的高低常被用來評價機體受氧化損傷程度輕重的重要檢測指標，而SOD則可以清除體內過多的氧自由基，抑制氧化應激反應。對于CD40L是否可以引起內皮細胞過氧化損傷鮮有報道。本實驗結果發現，rshCD40L刺激作用下的內皮細胞MDA含量顯著升高，而SOD活性則明顯下降，提示CD40L可誘導內皮細胞氧自由基損傷，降低內皮細胞抗氧化能力，破壞內皮細胞功能，可能為CD40/CD40L促進動脈粥樣硬化發生、發展的另一機制。另外，既往研究多提示CD40L對多種腫瘤細胞具有促凋亡和抑增殖作用，本研究發現，不同濃度的rshCD40L對內皮細胞的生存活性則無明顯影響，分析原因可能為腫瘤的免疫抑制特點，CD40/CD40L能夠為B細胞、T細胞提供活化的第一、第二信號，增加樹突狀細胞的抗原遞呈能力，控制癌細胞生長;另外，細胞間的相互作用不僅僅通過CD40/CD40L通路發揮損傷效應，同時存在其它機制協同擴大損傷反應，從而誘導細胞凋亡，而本研究中采用單因素的細胞因子造模，損傷程度相對減輕。盡管rshCD40L不能引起內皮細胞生存活性改變，但內皮細胞分泌的黏附分子(E-selectin、sICAM-1)、組織因子(TF)、脂質過氧化物(MDA)等損傷因子增多，而保護因子如TFPI、SOD則明顯減少，提示我們內皮細胞此時已經發生了早期功能障礙，處于應激-自我修復狀態。總之，rshCD40L能通過促進內皮細胞的炎癥、凝血反應，增加氧化應激反應來損傷內皮細胞，引起內皮細胞早期功能障礙。

減輕內皮細胞功能障礙、修復內皮細胞生理功能并早期發現能代表內皮細胞功能障礙的生物標志物對于動脈粥樣硬化的防治起重要作用。一些藥物如他汀類、氯吡格雷和傳統中醫中藥等發揮抗動脈粥樣硬化作用也與其能夠調節CD40/CD40L有關［14-16］。因此，針對CD40/CD40L進行早期干預、防治對內皮細胞功能損傷也成為動脈粥樣硬化治療的一個策略。［參考文獻］

［1］Poredos P.Endothelial dysfunction in the pathogenesis of atherosclerosis［J］.Int Angelol，2002，21(2) :109-116.

［2］van Kooten F，Ciabattoni G，Koudstaal PJ，et al.Increased platelet activation in the chronic phase after cerebral ischemia and intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，1999，30(3) :546-549.

［3］買尼沙·買買提，劉冬青，孟憲明，等.中國維吾爾族、漢族人群CD40L單核苷酸基因多態性與急性冠脈綜合征的相關性［J］.中國老年學雜志，2014，34(5) : 1198-1202.

［4］Schonbeck U，Libby P.The CD40/CD154 receptor/ligand dyad［J］.Cell Mol Life Sci，2001，58(1) :4-43.

［5］André P，Nannizzi-Alaimo L，Prasad SK，et al.Plateletderived CD40l the switch-hitting player of cardiovascular disease［J］.Circulation，2002，106(8) :896-899.

［6］Lievens D，Zernecke A，Seijkens T，et al.Platelet CD40L mediates thrombotic and inflammatory processes in atherosclerosis［J］.Blood，2010，116(20) :4317-4327.

［7］Henn V，Steinbach S，Buchner K，et al.The inflammatory action of CD40 ligand (CD154) expressed on activated human platelets is temporallylimited by coexpressed CD40 ［J］.Blood，2001，98(4) :1047-1054.

［8］Danese S，Fioeehi C.Platelet activation and the CD40/CD40 ligand pathway: mechanisms and implications for human disease［J］.Crit Bey Immunol，2005，25(2) : 103-121.

［9］渠晶，趙愛平，丁卜同，等.體內活化血小板表達CD40L及其對內皮細胞表達炎性因子的影響［J］.山東大學學報:醫學版，2014，52(3) :75-78.

［10］Xia M，Li G，Ma J，et al.Phosphoinositide 3-kinase mediates CD40 ligand-induced oxidative stress and endothelial dysfunction via Rac1 and NADPH oxidase 2［J］.J Thromb Haemostasis，2010，8(2) :397-406.

［11］Martínez de Lizarrondo S，Roncal C，Calvayrac O，et al.Synergistic effect of thrombin and CD40Lon endothelial MMP-10 expression and microparticle generation in vitro and in vivo［J］.Arte-rioscle Thromb Vasc Biol，2012，32 (6) : E1477-1487.

［12］Peterson JT，Li H，Dillon L，et al.Evolution of matrix metalloprotease and tissue inhibitor expression during heart failure progression in the infarcted rat［J］.Cardiovasc Res，2000，46(2) :307-315.

［13］Steffer J，Luscher TF，Tanner FC.Tissue factor in cardiovascular diseases: molecular mechanisms and clinical implications［J］.Circulation，2006，113(5) :722-731.

［14］Zhang XX，Duan W，We WB，et al.Effect of clopidogrel on platelet membrane CD40 ligand in coronary artery disease patients under taking percutaneous coronary intervention［J］.South China J Cardiol，2007，8(3) :133-134.

［15］秦合偉，劉萍.冠心康對載脂蛋白E基因敲除小鼠主動脈粥樣斑塊及CD40L表達的影響［J］.中華中醫藥學刊，2014，32(8) :1923-1926.

［16］尹明景，溫漢春，葉永維，等.高鹽高脂攝入致大鼠主動脈重構及辛伐他汀的阻斷作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28(2) :228-233.

通訊作者△Tel: 0311-85901553; E-mail: weitcm@163.com

*［基金項目］國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(No.2012CB518606)

［收稿日期］2014-10-15

［文章編號］1000-4718(2015)06-1111-04

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.025