草甘膦對銅綠微囊藻生長的影響及其機理研究

張 瓊，袁興超，裴兆虎，趙 健，韓 敏，鄧 濤

(濱州學院資源環境系，山東濱州256603)

草甘膦是近年來全球用量最大的除草劑之一，且隨著抗草甘膦轉基因作物的種植，其年使用量仍在不斷增加［1－2］。草甘膦可以通過葉面噴灑、大氣轉運、表面徑流等方式進入水體，近年來許多國家的水體里都發現了草甘膦和其主要的降解產物 AMPA 的殘留［3］。如 Couple［4］等發現，施用的草甘膦有0.009% ～0.860% 會進入地表水中。一般認為，草甘膦是環境友好型的除草劑，但是最近有較多研究表明，草甘膦對微生物、藻類、水生植物以及低等動物都有較大影響［5－8］。銅綠微囊藻是我國淡水水體中最常見的優勢藻種，因此它和草甘膦很可能在水生生態系統中共存。由于夏季水華的頻繁爆發，對銅綠微囊藻生長代謝的研究報道也一直較多。雖然也有不少學者關注外部環境因子如溫度、pH、藻種間競爭或營養鹽等對微囊藻生長變化的影響［9－10］，但水體是個復雜系統，往往也是各種污染物質的聚集場所。因此，外源性污染物如除草劑是如何對水體中這種優勢藻種的生長和繁殖產生影響的，產生這樣的效應的原因何在，當前的關注度還明顯不足。筆者研究了短期內不同濃度草甘膦對銅綠微囊藻生長和蛋白合成的影響，同時從銅綠微囊藻的抗氧化酶系統和對磷營養的代謝和轉化兩個方面，來深入探討其影響機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器 試驗所用的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)購自中國科學院武漢水生生物研究所(藻種庫編號905)。草甘膦原藥購自Iprochem公司(廣東深圳)，其他所有試劑均為分析純度。主要儀器為多功能酶標儀(Tecan infinite 200pro)和紫外-可見光分光光度計(UV1901)。

1.2 試驗方法

1.2.1 銅綠微囊藻的接種和培養。新購的藻種采用BG11培養基，經過反復接種2～3次后，再進行大規模培養。每次試驗的初始接種量約為106個細胞/ml藻液，培養3～4 d后，銅綠微囊藻即進入對數生長期，采用此時的銅綠微囊藻進行毒理學試驗。試驗時一次性加藥，連續培養4 d，每個處理設置4個平行。培養箱的溫度26±1℃，光照強度2 000 lx，光暗比為14 h∶10 h。培養容器為500 ml透明大三角瓶，瓶口用4層紗布密封，以防止被外界環境污染并可保持氣體流通。每天定時搖瓶3～4次，培養中始終保持光照條件均等。

1.2.2 銅綠微囊藻生物量和蛋白含量的測定。為測定銅綠微囊藻的生物量，先利用血細胞計數法數出細胞個數，再在680 nm下測出相應的吸光度，由細胞個數(C.D.)對吸光度(OD)作圖，得到一條標準曲線(C.D.=110.79×OD680+0.136 6，R2=0.996 1)。此后根據測得的樣品吸光度，計算樣品的細胞密度。銅綠微囊藻蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法，利用市售的試劑盒(南京建成生物工程公司)進行。

1.2.3 銅綠微囊藻細胞內的抗氧化酶活性及MDA含量的分析方法。收集培養4 d的藻液，每個樣品取30 ml，在4℃下6 000 r/min冷凍離心10 min，棄去上清液，余下的銅綠微囊藻沉淀加5 ml的PBS磷酸緩沖液和幾粒石英砂，在冰上研磨，冷凍保存。經過1～2次凍融，銅綠微囊藻細胞內的酶則釋放出來，此時再在4℃下，2 500 r/min冷凍離心10 min，取上清液，利用分光光度法進行過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)3種酶的活性以及脂質過氧化水平丙二醛(MDA)含量的測定和分析。具體分析都是采用購自南京建成生物工程公司的標準試劑盒進行。

1.2.4 藻細胞內外各種形態磷的測定。所有形態磷都先轉化為正磷酸鹽，然后用鉬藍顯色法進行測定。磷標準曲線由K2HPO4標準溶液繪制，試驗時現用現配。所有結果中的含磷量以mM P(mmol/L P)來表示。

1.2.4.1 細胞內外的正磷酸鹽測定［11］。取銅綠微囊藻藻液10 ml，6 000 r/min離心10 min。上清液直接取出用于細胞外正磷酸鹽測定;沉淀經過10% 的三氯乙酸提取后，調節pH至中性，用來測定細胞內正磷酸鹽。

1.2.4.2 細胞內外的總磷測定［11］。同樣取銅綠微囊藻藻樣10 ml，6 000 r/min離心10 min。上清液加1.0 g過硫酸銨和0.15 ml濃硫酸，水浴加熱(90～100℃)消化1.5 h。冷卻后調pH至中性，定容顯色后測定細胞外總磷含量;離心所得的沉淀先由6 ml蒸餾水取出，加4 ml 5% 的過硫酸銨，121℃消化30 min，冷卻后仍將pH調至中性，定容顯色后測定細胞內的總磷含量。

1.2.5 數據處理。利用SPSS18.0軟件進行統計顯著性分析(ANOVA法)和作圖。當P＜0.05時，處理間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同濃度草甘膦暴露下銅綠微囊藻生物量的變化 由圖1可知，隨著草甘膦濃度的增加，銅綠微囊藻的生物量先增加后減小，在10 mg/L時達最大;當草甘膦濃度升至20和40 mg/L時，銅綠微囊藻的生長又顯著被其抑制。最新的研究也發現，外源性污染物質如鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對銅綠微囊藻生長的影響也是較低濃度促進，但較高濃度抑制［12］。這說明外源性污染物質對微囊藻生長的影響與污染物濃度密切相關。

圖1 不同濃度草甘膦對銅綠微囊藻生長的影響

2.2 不同濃度草甘膦暴露下銅綠微囊藻蛋白含量的變化 由圖2可知，隨著草甘膦濃度的變化，銅綠微囊藻蛋白含量的變化趨勢與生物量完全一致。在草甘膦濃度較低時(5和10 mg/L)，與空白相比，該除草劑刺激銅綠微囊藻蛋白的合成，盡管這種刺激效應不顯著，但在草甘膦濃度較高時(20和40 mg/L)，對銅綠微囊藻蛋白的合成有顯著的抑制效應。蛋白是微囊藻細胞各種亞結構形成及一些重要的信號傳導通路中不可或缺的成分。由圖1和2可知，正是由于低濃度農藥的刺激作用，使得蛋白質的合成量增加了，也就使得這些處理組的生物量也相應增加;而高濃度組毒害效果明顯，首先是蛋白含量明顯下降，這將影響銅綠微囊藻一系列的生理生化反應，如氧化應激系統受到影響。

圖2 不同濃度草甘膦對銅綠微囊藻蛋白含量的影響

2.3 草甘膦對銅綠微囊藻細胞內抗氧化酶的活性與MDA含量的影響 由圖3可知，與空白相比，在草甘膦濃度較低時，CAT和POD活性略被刺激，但在高濃度時被顯著刺激，說明草甘膦的加入使得藻細胞受到了抗氧化損傷，進而清除這種損傷的相關酶類的活性被顯著激活了，特別是在高濃度組。所不同的是，SOD活性在低濃度時被顯著抑制，但在高濃度時又被顯著刺激。MDA是反映生物受到過氧化損傷的重要指標。與空白相比，所有添加除草劑的處理組，其MDA含量都有所增加，說明銅綠微囊藻確實受到草甘膦引起的氧化損傷。任何導致活性氧物質(ROS)形成的生物或非生物脅迫都可以產生氧化脅迫，植物或微生物運用自身的抗氧化防御系統來抵御這種氧化損傷，各種抗氧化酶是生物體內最有效的抗氧化損傷的武器［13］。CAT是用來清除活性氧物質H2O2的，而POD在植物體內的催化反應也是以H2O2等自由基為底物。同時，POD也是組織老化的一種生理指標。試驗結果表明，高濃度加藥組藻細胞的變色和沉淀現象較為明顯，這也證明了細胞在走向老化和衰亡。另外，在高濃度組，草甘膦對微囊藻細胞的損傷仍舊不可逆轉，進而使得高濃度處理組生物量和蛋白合成顯著被抑制(圖1和圖2)。所不同的是，SOD是一種廣泛存在于動植物、微生物中的金屬酶，它能催化生物體內的ROS生成超氧自由基(·O2－)。盡管高濃度組SOD的活性被顯著激活，但在草甘膦濃度較低時，SOD活性被顯著抑制(圖3c)，這種抑制作用可能造成微囊藻體內·O2－的累積，同樣也引發微囊藻的氧化損傷(圖3d)。

圖3 草甘膦對銅綠微囊藻的抗氧化酶活性與丙二醛含量的影響

2.4 草甘膦加入對銅綠微囊藻細胞內外磷利用情況的影響 研究表明，在水體中各種形態的磷中，只有正磷酸鹽才可被生物直接利用。部分有機磷農藥的加入，改變了這部分磷占總磷的比例，進而有可能改變水中銅綠微囊藻對營養成分磷的利用情況。由圖4可知，細胞外正磷酸鹽所占比例在草甘膦濃度為5 mg/L時達最大，20 mg/L時降至最低，但細胞外總磷含量最大。LI等的最新研究發現［14］，銅綠微囊藻可以通過調節其生理代謝功能來適應外界環境的變化，當外界正磷酸鹽濃度不足時，也可以利用溶解性的有機磷。試驗結果表明，溶解性較好的除草劑草甘膦在濃度為5和10 mg/L時，的確刺激了微囊藻的生物量和蛋白合成，這可能是由于草甘膦的加入使得培養液中微囊藻可以直接利用的正磷酸鹽的比例和含量都增加了。

圖4 銅綠微囊藻細胞外總磷、正磷酸鹽含量及正磷酸鹽所占比例

由圖5可知，在草甘膦濃度為10 mg/L時，盡管此時細胞內的總磷含量最低，但藻細胞可以直接利用的正磷酸鹽比例卻最高;而草甘膦濃度為40 mg/L時，總磷濃度較高，但藻細胞能直接利用的正磷酸鹽含量和比例均最低。這表明較低濃度的除草劑可以改善微囊藻體內磷營養的存在狀態，進而刺激微囊藻生長，而高濃度除草劑則降低磷營養的可利用性，從而抑制了微囊藻的生長。研究表明，在黑暗和氧化還原電位下降等逆境中，銅綠微囊藻細胞內磷代謝的狀況會發生改變。例如，細胞內部聚合磷酸鹽的積累速度和磷釋放速度會大大增加，這就有利于維持必要的磷濃度并儲存一定的能量，進而維持藻細胞正常的生理功能［15］。該試驗中外源污染物草甘膦也是一種逆境脅迫，低濃度時明顯改善了銅綠微囊藻細胞內可直接利用的磷的比例，最終表現為生長刺激現象。3

圖5 銅綠微囊藻細胞內總磷、正磷酸鹽含量及正磷酸鹽所占比例

結論與討論

(1)在實際環境中，低劑量刺激、高劑量抑制的污染物作用效應在毒理學中廣泛存在，所以污染物對生物的效應通常表現為一種“倒U”型曲線［16］。在該試驗中也存在這種現象，這種低濃度草甘膦刺激銅綠微囊藻生長的現象需要引起重視，這在某種程度上更加促進了藻類的過量繁殖，加重了富營養化水體的危害程度。

(2)從銅綠微囊藻的抗氧化防御系統來看，CAT、POD和SOD酶的活性在所有草甘膦處理組幾乎都被顯著激活，這表明銅綠微囊藻確實可以利用抗氧化酶來抵御草甘膦所誘發的氧化損傷，但短期內這種防御系統的效果只局限于較低濃度的草甘膦。與空白相比，高濃度草甘膦處理組盡管酶活性很高，草甘膦仍然會誘發銅綠微囊藻藻密度下降和蛋白合成受阻等毒性效應。

(3)銅綠微囊藻細胞內外各種形態的磷代謝和轉化隨草甘膦濃度的變化差異明顯。添加草甘膦后，細胞內外可直接利用的磷形態——正磷酸鹽的含量和所占比例在低濃度組較大、高濃度組較小，可能直接造成了銅綠微囊藻的生長刺激或抑制效應。

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