中華鱘外周血細胞的顯微結構

姚德冬，柴毅，王毅，郭坤，黃俊 （長江大學動物科學學院，湖北荊州434025）

血細胞是魚類機體免疫的重要組成部分，對維持魚類機體內環境的穩定有重要作用，其部分參數可反映魚類的健康狀況［1］。國內外有很多關于魚類血細胞形態結構的研究［2～9］。

中華鱘 （Acipenser sinensis）隸屬鱘形目 （Acipenseriformes）鱘科 （Acipenseridae）鱘屬 （Acipenser），主要分布在長江流域，是典型的溯河洄游魚類。由于過度捕撈、葛洲壩等水利工程建設、江上作業和水域污染等原因，中華鱘野生種群數量急劇下降，1988年中華鱘被列為國家一級保護動物［10］。目前有關中華鱘的研究報道主要集中在人工繁殖、行為學、生理生化等方面的研究［11～13］，但是專門對中華鱘外周血細胞形態結構的研究比較少。本研究對中華鱘血細胞的顯微結構進行觀察，旨在為中華鱘血液學、疾病診斷的研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

選取4尾養殖中華鱘進行血液樣品采集。實驗魚健康狀況良好，均為雌性，體長162～182cm，體重20．7～36．7kg。

1．2 試驗方法

1．2．1 采血方法

用帆布擔架撈取實驗魚后，腹部朝上，鰓部供水。擦去臀鰭后的水分，用5mL 一次性注射器自尾鰭基部下方的尾靜脈抽取靜脈血2mL，迅速將血液注入附有EDTA－K2的抗凝管中，顛倒180度5～8次混勻后，放入4℃冷藏箱中，帶回實驗室待測。

1．2．2 紅細胞密度統計

按林浩然［14］的方法進行。

1．2．3 白細胞分類計數和各類血細胞大小測量

抗凝血在干凈載玻片上涂片，晾干，用瑞氏－吉姆薩染液聯合染色。在Leica顯微鏡油鏡下進行血細胞觀察、測量細胞大小，用南京倍寧醫學病理成像系統進行觀察、拍照。每尾實驗魚制作2張血涂片，每張涂片上計數200個白細胞，對1600個白細胞進行分類計數。在測量細胞大小時，除數量極少的嗜酸性粒細胞外，其余各種血細胞大小取50次測量平均值。

1．3 數據處理

實驗數據用Excel軟件進行處理，結果均以平均值±標準差 （Mean±SD）表示；照片用Photoshop 7．0進行處理，同比例縮放圖像和標尺。

2 結果與分析

2．1 中華鱘外周血細胞的顯微形態結構

通過顯微鏡觀察發現，中華鱘血涂片中紅細胞的數量最多，白細胞數量較少且單個或少數幾個聚集分散在紅細胞之間。白細胞包括淋巴細胞、血栓細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞，未觀察到嗜堿性粒細胞。

2．1．1 紅細胞 （erythrocyte）

紅細胞呈橢圓或卵圓形，表面光滑；細胞核形狀與細胞形狀相似，位于細胞中央，少數略偏位，細胞質豐富。細胞核內染色質疏松，被染成紫紅色，無核仁，細胞質被染成粉紅色。部分血涂片染色過程中環境偏堿性，細胞呈灰藍色。此外，還觀察到紅細胞裂解后形成的 “核影”，被染成粉紅色 （圖1（a））。

2．1．2 淋巴細胞 （lymphocyte）

淋巴細胞呈圓形、橢圓形或不規則形，占據多半細胞空間。細胞質較少，有的呈一薄層包裹細胞核，有的向外伸出形成明顯的偽足突起 （圖1 （b）），有的不可見，細胞近似裸核 （圖1 （b））。細胞核內染色質致密呈塊狀，被染成深紫色，細胞質被染成淺藍色。

2．1．3 血栓細胞 （thrombocyte）

血栓細胞呈長桿形 （圖1 （c）、（d）、（e））、圓形 （圖1 （c））或橢圓形，表面光滑。細胞核呈長桿形、橢圓形或腎形等，位于細胞中央，少數偏位，細胞質較少，僅一薄層包裹細胞核；細胞核內染色質致密，被染成紫紅色，細胞質染色較淡，呈粉紅色，血栓細胞在血涂片中常見到單個或數個聚集在一起出現（圖1 （d））。

2．1．4 單核細胞 （monocyte）

單核細胞呈橢圓形、圓形或不規則形。細胞核形狀多種多樣，包括圓形、橢圓形、腎形或馬蹄形等，常偏于細胞一側，細胞質較豐富；細胞核內染色質疏松，被染成紫紅色，無核仁，細胞質被染成灰藍色，染色不均勻且含有空泡 （圖1 （e）、（f））。在顯微鏡下，單核細胞和淋巴細胞有時難以區分，前者染色質疏松不勻，細胞質染色灰藍色，朦朧模糊，而后者染色質致密呈塊，染色質淺藍色，清晰透明（圖1 （f））。

2．1．5 嗜中性粒細胞 （neutrophil）

嗜中性粒細胞呈圓形、卵圓形 （圖1 （g））或不規則形 （圖1 （h））等，細胞核為腎形、馬蹄形或分葉形等，常偏于細胞一側與細胞膜相切，細胞質豐富。細胞核內染色質疏松，被染成紫紅色，無核仁，細胞質染色較淺，呈淡粉紅色，有的甚至是無色。

2．1．6 嗜酸性粒細胞 （eosinophil）

嗜酸性粒細胞呈圓形或卵圓形，細胞核為腎形或分葉形等，常偏于細胞一側，細胞質豐富。細胞核內染色質致密，被染成紫紅色，細胞質中充滿了均勻飽滿的嗜酸性顆粒，被染成橘紅色。在血涂片中偶爾見到，數量極少。

圖1 中華鱘外周血細胞的顯微結構

2．2 白細胞分類計數和各類血細胞大小測定

中華鱘白細胞分類計數和各類血細胞大小測定結果見表1。從表1中可以看出，在細胞數量上，中華鱘白細胞中以血栓細胞數量最多，占白細胞總數48．56%；其次是淋巴細胞，占白細胞總數32．44%；嗜中性粒細胞和單核細胞分別占10．25%和8．38%；嗜酸性粒細胞數量最少，僅占白細胞總數0．37%，極為少見。在細胞大小上，中華鱘白細胞中嗜中性粒細胞的體積最大，其細胞大小為 （20．29±1．62）μm× （16．07±2．89）μm；細胞核大小為 （16．32±1．54）μm× （12．34±2．27）μm；淋巴細胞的體積最小，其細胞大小為 （9．74±2．65）μm× （7．20±0．97）μm；細胞核大小為 （8．34±1．24）μm×（6．83±0．74）μm。紅細胞計數結果為 （4．82±0．15）×1011個／L。

表1 中華鱘各類血細胞大小和白細胞分類計數值

3 討論

3．1 中華鱘血細胞組成

中華鱘外周血中紅細胞數量占大多數，白細胞數量較少。林光華等［15］認為淡水養殖魚類血液白細胞以淋巴細胞為主，但在中華鱘白細胞中，血栓細胞數量最多，這與美國紅魚 （Sciaenops ocellatus）［16］、淡水石斑 （Cichlasoma managuense）［17］、軍曹魚 （Rachycentron canadum）［2］、長鰭裸頰鯛（Lethrinus erythropterus）［5］、切尾擬鲿 （Pseudobagrus truncatus）［4］、小點貓鯊 （Scyliorhinus canicula）［8］、澳洲黑鯛 （Acanthopagrus australis）［7］等相同。嗜酸性粒細胞最少，這與稀有白甲魚 （Onychostoma rara）［6］、淡水石斑［17］、切尾擬鲿［4］等情況相似。粒細胞中，嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞均存在，但并未發現嗜堿性粒細胞，這與稀有白甲魚［6］、淡水石斑［17］、華鯪 （Sinilabeo rendahli）［18］、切尾擬鲿［4］等結果一致；但美國紅魚［16］、犬牙韁蝦虎魚 （Amoya caninus）［3］、斑點叉尾鮰 （Ietalurus punetaus）［19］、長鰭裸頰鯛［5］的外周血液中均發現嗜堿性粒細胞。Watson等［20］認為嗜堿性粒細胞在制片過程中極易解體，很難觀察到。林光華等［21］則發現草魚 （Ctenopharyngodon idellus）嗜堿性粒細胞只在幼齡魚魚種出現，在成年魚外周血液中沒有。周玉等［22］指出魚類白細胞分類存在種間差異。本研究中未發現嗜酸性粒細胞，可能是實驗過程中導致嗜堿性粒細胞解體，也可能是因為實驗魚不是幼魚，或者中華鱘血液中沒有嗜堿性粒細胞，具體原因需進一步研究。

3．2 中華鱘與其他鱘魚的血細胞特征比較

中華鱘的外周血液中發現了嗜酸性粒細胞，并未發現嗜堿性粒細胞，這與達氏鰉 （Huso dauricus）［23］、高 首 鱘 （Acipenser transmontanus）［19］研 究 結 果 一 致；但 是 在 史 氏 鱘 （Acipenser schrenckii）［24］研究中，發現其血細胞中有嗜堿性粒細胞，沒有嗜酸性粒細胞。中華鱘血細胞中，嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞細胞體積較大，淋巴細胞和血栓細胞較小，與達氏鰉研究結果一致，但是中華鱘外周血細胞數量少于達氏鰉，中華鱘血細胞體積大于達氏鰉，這可能跟2種鱘魚的年齡、生活環境等有關。

本研究在白細胞分類計數時將血栓細胞歸為白細胞，而在達氏鰉［23］、史氏鱘［24］的研究中并未將血栓細胞歸為白細胞；作者在光鏡下發現中華鱘淋巴細胞大小、著色及形態特征均無明顯差異，將其歸為一類細胞；章龍珍等［24］也沒有對史氏鱘的淋巴細胞進行分類，但是周玉等［23］通過電鏡對淋巴細胞內的線粒體、粗面內質網、核孔和核周隙的觀察，將達氏鰉的淋巴細胞分為大小2類。因此，中華鱘和達氏鰉、史氏鱘的白細胞分類計數統計結果不便比較。

魚類白細胞分類仍然有很大爭議。在軍曹魚［2］、犬牙韁蝦虎魚［3］、切尾擬鲿［4］等魚類研究中，血栓細胞都歸為白細胞一類；而林光華等［15］將鰱 （Hypophthalmichthys molitrix）、鳙 （Aristichthys nobilis）的血栓細胞劃分到白細胞系以外。除血栓細胞的歸屬，淋巴細胞的分類也不相同。很多學者［3～5］將淋巴細胞分成大小2類；Barber等［25］認為淋巴細胞體積是連續變化的，不能用 “大”、 “小”來界定；Ellis［26］也認為不同大小的淋巴細胞可能是同一種細胞的不同功能狀態。作者認同周玉等的觀點，對于魚類白細胞的分類應采用統一標準，便于學術交流。

3．3 中華鱘血細胞特征與其生態適應性

紅細胞是魚體內運輸氧氣的主要媒介。林浩然［27］指出魚類運動能力強弱與其紅細胞數量和大小有關；楊嚴鷗等［28］也認為紅細胞數量由大到小的順序與魚類運動水平由高到底的順序是一致的。中華鱘紅細胞與常見的白鰱、鳙、草魚、鯉魚 （Cyprinus carpio）等鯉科魚類紅細胞相比，數量要少，體積要大，說明中華鱘游泳能力比上述鯉科魚類要弱；這與蔡露［29］在研究4種鱘科魚類游泳能力時得出的結果一致。中華鱘的紅細胞特征可能是其適宜在水流速度較慢的水底生活，以一些行動遲緩的底棲動物為食的原因。

魚類血栓細胞具有凝血功能，淋巴細胞是魚類機體免疫的重要組成部分。中華鱘的白細胞是以血栓細胞和淋巴細胞為主體的系統，兩者占白細胞總數的81%；這也可能與中華鱘是大型溯河洄游性魚類，在礫石底質的江段產卵有關。遠距離運動和產卵過程中容易受傷，白細胞以血栓細胞和淋巴細胞為主體的系統，能夠使得中華鱘在受傷后快速凝血，并將侵入體內的病原殺死，形成免疫保護。

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