固態發酵法降解油茶粕中單寧的研究

2015-12-04 01:34:24刁歡湯強廖應升安徽新華學院藥學院安徽合肥230088

長江大學學報(自科版) 2015年21期

刁歡，湯強，廖應升（安徽新華學院藥學院，安徽合肥230088）

油茶是我國南方地區的一種木本油料作物，油茶粕是油茶經榨油后的殘渣，是一種營養價值較高的工業副產品。油茶粕營養成分豐富，主要有粗蛋白（10%～15%），粗脂肪（5%），糖類（30%～40%）、粗纖維（15%～20%）和水分（14%），以及對動物生長發育有利的必需微量元素 Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu［1］。因此，油茶粕是一種優良的天然植物蛋白資源，可作為優質的蛋白飼料源。然而，由于油茶粕中含有茶皂素、單寧等多種抗營養因子，從而限制了其在飼料中的應用。

單寧（Tannin）又稱單寧酸（Tannic acid）、鞣質，是一種廣泛存在于植物體內的多元酚類化合物的統稱，其相對分子質量一般為500～3000。由于單寧味苦澀影響飼料的適口性，從而降低了動物攝食率［2］。過量的單寧還可降低蛋白質、氨基酸的消化率，并損傷腸壁，進而影響動物的生長發育［3］；再者，單寧可與消化道黏膜蛋白結合，形成不溶性復合物排出體外，增加了內源氮的排泄量。研究表明，單寧酶可水解沒食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖，且單寧酶屬于誘導酶，主要利用微生物發酵生產獲得［4，5］。因此，通過微生物發酵的方法產生單寧酶，促進單寧的有效生物降解，是生產中將油茶粕轉化為優質蛋白質飼料源的關鍵。本研究擬采用發酵過程中可產生單寧酶、發酵能力強的黑曲霉和酵母菌作為菌種［6，7］，從溫度、pH、發酵時間等因素出發，研究微生物固態發酵中單寧酶產生和單寧降解的最佳條件，并將單寧含量調控到對動物體有益的范圍［8］，以期為油茶粕作為蛋白質飼料源使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉、酵母菌購于中國工業菌種保藏中心。

1.1.2 固態發酵培養基

油茶粕培養基：油茶粕13g、可溶性淀粉1g、尿素1.5g、磷酸氫二鈉0.05g、七水硫酸鎂0.015g、牛肉膏0.2g、七水硫酸亞鐵0.03g、酵母膏0.5g、蒸餾水100mL，自然pH，121℃滅菌20min。

PDA培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、自來水1000mL，自然pH，121℃滅菌20min。

1.1.3 種子液的培養

酵母種子液的培養：將酵母菌從斜面培養基接種至裝有50mL麥芽汁液體培養基的250mL三角瓶中，30℃、160r／min培養24h。

霉菌種子液的培養：將霉菌從斜面培養基接種至裝有50mLPDA液體種子培養基的250mL三角瓶中，30℃、160r／min培養24h。

混菌按照接菌比例1∶1。

1.1.4 主要儀器設備

DA－180M型顯微鏡、AL204型電子天平、PHS－3C精密酸度計、HH－S型水浴鍋、Lac－5060S滅菌鍋、Lab－Tech SPX智能型培養箱、HZQ－QG型振蕩器、721型分光光度計。

1.2 發酵條件優化方法

1.2.1 發酵時間的優化

取培養基中的菌液，以10%的接種量接種于油茶粕培養基中，在恒溫30℃、pH 5的條件下進行培養，分別在發酵1、2、3、4、5、6d后取樣測定單寧的含量。設置未接菌種的油茶粕培養基作為對照組，每個處理3個重復。

1.2.2 pH的優化

取培養基中的菌液，以10%的接種量接種于油茶粕培養基中，恒溫30℃下，分別在pH為3、4、5、6、7、8條件下發酵3d后取樣測定單寧含量，設置未接菌種的油茶粕培養基作為對照，每個處理3個重復。

1.2.3 發酵溫度的優化

取培養基中的菌液，以10%的接種量接種于油茶粕培養基中，自然pH（pH 6.6～7.0）下，分別在10、15、20、25、30℃和35℃下發酵3d后取樣測定單寧含量，設置未接菌種的油茶粕培養基（發酵溫度30℃）作為對照，每個處理3個重復。

1.3 單寧的測定

單寧含量的測定方法采用分光光度法，參照林業行業標準《單寧酸分析試驗方法》（LY／T 1642－2005）［9］進行。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間對不同菌種發酵的油茶粕中單寧含量的影響

隨著發酵時間從1d逐漸增加到6d，不同菌種對油茶粕中單寧的分解能力呈現先升高后降低趨勢，其中混菌發酵油茶粕單寧含量在3d時降低到最小值0.52%（占油茶粕總量的比例），但隨著發酵時間延長至4～6d后，3個處理之間無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.2 不同發酵pH對不同菌種發酵的油茶粕單寧含量的影響

隨著pH從3上升到8，不同菌種對油茶粕中單寧的分解能力呈現先升高后降低趨勢，其中混菌發酵油茶粕單寧含量在pH為5時降低到最小值，且顯著低于對照組和其他試驗組（P＜0.05），此時單寧含量為0.51%（表2）。

2.3 不同發酵溫度對不同菌種發酵的油茶粕單寧含量的影響

隨著發酵溫度從15℃上升到35℃，油茶粕中單寧的分解能力呈現先升高后降低趨勢。混菌發酵油茶粕的單寧含量在28℃時降低到最小值0.48%，顯著低于對照組和其他處理組（P＜0.05）（表3）。

表1 不同發酵時間下不同菌種發酵后的油茶粕中單寧的含量

3 小結與討論

試驗結果表明，不同發酵條件下，微生物發酵能夠有效降解油茶粕中單寧，且對單寧的降解能力呈現先升高后降低趨勢，其中黑曲霉和酵母菌的混菌試驗組在發酵時間3d時，油茶粕中單寧含量降低至0.46%，顯著高于其他試驗組和對照組。

發酵時間為4d以上時，各處理組之間單寧含量沒有顯著差異。綜合各菌種在不同時間段對油茶粕中單寧的降解結果，以混菌發酵效果最好，更符合實際生產要求。考慮到發酵時間延長會帶來的生產成本的增加，以及油茶粕中單寧含量的升高，較適宜的發酵時間為3d。

溫度和pH對發酵結果的主要影響是其對微生物的生長和相應酶活性的影響［10］。研究表明，真菌和植物產單寧酶pH穩定范圍一般在4～6之間［11］。當混菌所分泌的單寧酶在pH為5時，有最強的活性。本研究中pH在5左右時，混菌對油茶粕中單寧的分解效果最顯著，表明此時混菌分泌的單寧酶有最強的活性。

本研究中，發酵起始溫度在28℃時，混菌對油茶粕中的單寧具有顯著降解效果。這與蘇二正等［12］、郭魯宏等［13］的研究報道結果相符。28～32℃為黑曲霉最佳發酵培養溫度范圍，可能因為本研究中試驗是在三角瓶中發酵，過程中產生了大量的熱，而物料的熱傳導率低，導致短時間內熱量難以消散；此外，在發酵過程中物料的收縮和空隙的減少也使熱量難以消除，起始發酵溫度稍低，經過發酵后發酵瓶內的溫度升高，酶活性增強。