嵌合抗原受體修飾T細胞在腫瘤免疫治療中的研究進展

趙媛媛，孔寧，王毅

吉林大學藥學院，長春 130021

*論著——腫瘤治療技術*

嵌合抗原受體修飾T細胞在腫瘤免疫治療中的研究進展

趙媛媛，孔寧，王毅

吉林大學藥學院，長春 130021

近年來，作為新型腫瘤免疫治療技術，嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細胞在惡性腫瘤的治療中取得了很好的成果，為部分晚期患者帶來了康復的希望。CAR是利用基因工程技術將能夠與腫瘤抗原結合的受體部分與胞內的信號轉導部分相結合而形成的一種新型受體，經CAR修飾的T細胞可通過非MHC限制性的方式殺傷腫瘤細胞。本文就近年來CAR-T療法的研究進展及其在惡性腫瘤臨床治療的應用進行綜述。

嵌合抗原受體；T細胞；腫瘤；免疫治療

近幾十年來，腫瘤的傳統療法（包括手術治療、化學治療、放射治療等）取得了一定的效果，然而患者的生存率低、腫瘤復發和轉移仍然是有待攻破的難題。隨著研究的不斷深入，腫瘤的免疫治療逐漸成為可能會解決這些問題的途徑。與傳統抗癌療法不同，腫瘤免疫治療的靶標并不針對腫瘤細胞和腫瘤組織，而是針對人體自身的免疫系統。其中，使抗原抗體的高親和性和T細胞的殺傷作用相結合，構建基于腫瘤特異性的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的T細胞免疫療法發展非常迅速，通過基因轉導使T淋巴細胞表達這種嵌合抗原受體后，T細胞在體內能夠特異性地識別腫瘤抗原、有效殺傷腫瘤細胞。在近25年的時間里，嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）在體內實驗和臨床試驗中均表現出良好的靶向性、殺傷活性和持久性，在治療白血病［1-2］、淋巴瘤［3］、腦膠質瘤［4］和卵巢癌［5］等惡性腫瘤方面取得了令人欣喜的療效。本文對CAR-T技術的研究進展及其在治療惡性腫瘤的臨床應用進行了如下綜述。

1 CAR-T作用原理

T 細胞是人體內特異性抗腫瘤的效應細胞，但其發揮作用具有MHC （major histocompatibility complex，主要組織相容性復合體）限制性。1989 年，Gross等［6］首次提出構建特異性嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），即使T 細胞受體（ T cell receptor，TCR） 的亞基與腫瘤抗原單克隆抗體的單鏈可變區兩者相結合，再通過一定途徑將編碼CAR的基因插入T細胞，修飾后的T細胞經體外擴增和純化后回輸入到體內，構建的 CAR-T細胞在體內既能特異性識別并結合腫瘤抗原，又具有T細胞自我更新和殺傷的能力。T細胞經基因修飾后獲得了靶向殺傷活性，不受腫瘤局部免疫微環境的抑制，從而打破宿主的免疫耐受狀態，使T細胞以非MHC限制性的方式特異性殺傷腫瘤細胞。

2 CAR主要結構

CAR的結構主要包括三部分：胞外抗原結合區、跨膜區以及胞內信號肽區。其中CAR的胞外區決定其特異性。胞外結合區的主要構成是腫瘤抗原特異性的單克隆抗體單鏈的可變區序列（輕鏈可變區和重鏈可變區由鉸鏈區連接），其作用是特異性識別靶細胞表面的特異性抗原。CAR的跨膜區由CD3、CD4、CD28等構成。CAR的胞內信號區通常是T細胞受體TCR/CD3ζ鏈、免疫球蛋白Fc受體FcεRIγ鏈，這部分含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine -based activation motifs，ITAMs），主要發揮信號轉導功能［7］。

3 CAR結構發展歷程

二十多年來，人們不斷改進CAR的結構，如今CAR已發展到第4代。第1代CAR能夠成功識別靶抗原并激活T細胞，但由于胞內信號肽區只表達單一的信號分子（TCR/CD3ζ鏈或免疫球蛋白Fc受體FcεRIγ鏈），缺乏協同刺激分子，從而不能充分激活T細胞，導致其修飾的 T 細胞增殖能力較低，細胞因子分泌水平也不高，無法在體內持續維持抗腫瘤效應。第2代CAR的信號區添加了一個協同刺激分子，因此在腫瘤細胞被CAR-T識別后，CAR中的協同刺激分子和胞內信號能夠同時被活化，即實現雙重活化，使T 細胞持久增殖并持續釋放細胞因子，從而使細胞殺瘤活性大大提升［8］。第3代CAR在胞內信號區整合了2個以上的協同刺激分子，T細胞持續活化、增殖的能力得以實現，細胞因子的分泌得以持續，從而使T細胞增殖分泌能力和殺傷腫瘤細胞能力明顯增強。第4代CAR（又稱TRUCKs）在第3代CAR的結構基礎上，又增加了編碼CAR及其啟動子的載體。這樣，在轉基因產生的細胞因子作用下，CAR能夠產生更有效的信號； 此外，IL-12等細胞因子還可以招募免疫系統的其他成員，使得抗腫瘤免疫效應得以放大［9-10］。

4 CAR-T在臨床治療中的應用

傳統的腫瘤治療方式包括手術治療、化學治療和放射治療等，而作為一種新型細胞免疫療法，CAR-T所具有的優勢是腫瘤傳統療法無法比擬的。CAR-T細胞能夠特異性地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞損傷較小，并且沒有放、化療的毒副作用，因此耐受性較好。同時CAR-T能重建并增強患者機體的免疫功能，可長期對抗腫瘤。近年來，隨著 CAR 結構的不斷優化，CAR-T 也由實驗室走向了臨床試驗［11］。

4.1 CAR-T應用于血液系統腫瘤的治療

惡性淋巴瘤、白血病以及多發性骨髓瘤是常見的血液系統腫瘤，這幾類腫瘤的發病率逐年升高，在惡性腫瘤中占較大比重。與放療、化療等傳統療法不同，CAR-T技術能夠特異殺傷腫瘤細胞，毒副反應小，患者耐受性好，對難治性和復發性惡性腫瘤效果顯著，在治療血液系統腫瘤方面具有較好的效果。

4.1.1 B細胞惡性腫瘤

B細胞腫瘤的細胞表面表達腫瘤特異性抗原CD19，目前開展的B細胞惡性腫瘤臨床試驗大多是應用靶向的CAR-T細胞。B細胞以及95%以上的B細胞惡性腫瘤表面均特異性表達CD19，，并且CD19在B細胞的不同分化階段均持續表達［12］。因此構建能夠識別CD19分子的CAR-T細胞，對絕大多數B系腫瘤具有治療作用。

Kochenderfer在2010年對一名難治性淋巴瘤患者復發后進行了CAR-T（CD19-CAR-T）治療，治療后病人的病情明顯緩解了較長時間［13］。隨后，Porter等一項利用CAR-T進行了白血病治療的臨床試驗取得了成功，這一成果轟動了整個腫瘤研究領域［14］。Kochenderfer等在2014年公布了一項CAR-T療法治療B細胞腫瘤（CTL019）的最新研究數據，該項研究針對復發難治性急性淋巴細胞白血病，總共有39名兒童接受CTL019治療，治療后36名兒童（92%）達到了完全緩解，并且25名響應者在治療結束6個月后仍處于緩解中，存活率達75%［15］。

除了構建CD19的CAR-T細胞， 還有研究者篩選新的靶標抗原，包括κ免疫球蛋白輕鏈［16］、BCMA（B-cell maturation antigen，B細胞成熟抗原）［17］、CD20［18］等，且許多研究均取得了較好成果。

4.1.2 急性淋巴細胞白血病目前大多數急性淋巴細胞白血病（acute lymphoi pneumonia，ALL） 患者不能夠治愈，而CAR-T療可能會緩解他們的病情。2013年《新英格蘭醫學雜志》報道了兩例復發難治性ALL的兒童患者在接受抗CD19CAR-T細胞治療后，兩名患者均獲得了完全緩解（complete remission，CR），同時在患者的腦脊液和骨髓中均發現了特異性T細胞［19］。Brentjens等報道了 5例復發難治性ALL成人患者在接受抗CD19CAR-T細胞治療后也獲得了完全緩解［20］。

4.2 CAR-T在實體瘤治療中的應用

近年來，CAR -T 細胞在神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等實體腫瘤中也顯示出良好的抗腫瘤效應。

4.2.1 神經母細胞瘤

在治療神經母細胞瘤的臨床試驗中，經第1代CAR-T修飾后的T細胞雖能成功進入患者體內，但由于其CAR結構僅有單一信號（CD3ζ或FcεRIγ），T細胞不能被有效激活，導致抗腫瘤效應持續時間較短，并未顯示出明顯的抗腫瘤效果。并且第1代CAR結合的單鏈抗體是鼠源，該CAR修飾的T細胞輸入患者體內后會被患者自身產生的抗鼠抗體中和［21］。

隨著CAR結構的不斷發展，第1代CAR-T細胞逐漸被第2、3代CAR-T細胞所取代，從而廣泛應用于臨床試驗：Louis［22］在治療神經母細胞瘤的臨床試驗中發現，對處于活動期的神經母細胞瘤患者應用CAR-T細胞治療后，患者病情得到完全緩解，取得了顯著的抗腫瘤作用。

4.2.2 黑色素瘤

在Morgan［23］研究中，17 名轉移性黑素瘤患者接受了CAR-T 細胞治療（靶向人黑素瘤標志物，α-MART-1），其中腫瘤完全消退患者為2 例，其它15 例患者的外周血中持續存在高比例的回輸T 細胞（ 9% ～ 56%） ，而且病情穩定。另外，Gargett［24］在治療黑色素瘤的體外實驗中，聯合應用CAR-T與激酶抑制劑，實驗結果顯示二者聯合應用具有協同治療黑色素瘤的作用，提示該方法的臨床應用前景非常廣闊，有望進行進一步研究。

此外，還有以人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、上皮黏蛋白（ mucin-1，MUC-1）為靶點治療乳腺癌［25-26］，以癌胚抗原（carcinoembryonic antigen， CEA）為靶點治療結腸癌［27］、以前列腺特異性膜抗原（ prostate specific membrane antigen，PSMA）為靶點治療前列腺癌［28］等，多數都取得了一定的臨床效果。

5 安全性挑戰

CAR-T細胞療法作為一種新型免疫治療惡性腫瘤的方法，在其為晚期惡性腫瘤患者帶來治愈希望的同時，其在治療過程中的不良反應依舊需要得到重視，特別是一些致命的不良反應。因此在開展CAR-T細胞治療的同時，還要重視CAR-T應用的安全性問題。

5.1 脫靶效應

首先就是脫靶效應，即大多數 CAR 定向的靶抗原不是腫瘤特有的，其在正常組織中有不同程度的表達， 因此CAR 修飾的免疫細胞在攻擊腫瘤組織的同時也會損傷正常組織。因此可以使CAR-T細胞表達的嵌合抗原受體為兩種或兩種以上，而一般只表達一種抗原的正常組織細胞就可以避免受到CAR-T的損傷［29］，或者選擇僅表達于腫瘤細胞表面的靶抗原，使之特異性結合于腫瘤細胞而不會結合到正常組織細胞。

5.2 細胞因子風暴

其次需要重視的不良反應就是“細胞因子風暴”。在第 2、3 代CAR中引入了 1 個或多個共刺激分子，使得細胞活化、增殖、殺傷能力大幅度增強，同時在細胞治療過程中有多種細胞因子，如白介素（interleukin，IL）-1、IL-6、γ-干擾素等大量釋放到機體循環系統中，引起惡心、頭痛、心動過速、呼吸急促等臨床癥狀，嚴重者可導致急性呼吸窘迫綜合征或多器官功能衰竭，這就是所謂的“細胞因子風暴”［30］。針對這一問題，不僅要設計安全的CAR-T細胞，還要嚴格限制每次輸注患者體內的細胞數量，從而降低該不良反應的發生。

6 展望

在腫瘤免疫細胞治療領域，嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）代表當今最先進的技術，隨著現代生物科學的發展，CAR-T越來越受到大家的重視。腫瘤的臨床治療和基礎是現在腫瘤學研究的重點［31-32］。在腫瘤免疫治療方面，CAR-T 的臨床試驗結果顯示其有著無可比擬的優勢，然而在技術提升和大規模臨床應用方面，CAR-T仍然存在著許多挑戰。如何提高CAR-T 細胞特異性殺傷腫瘤的能力以及用于臨床治療的安全有效性是目前CAR-T治療急需解決的難題。隨著研究的深入和技術的日益提高，相信CAR-T療法一定會在腫瘤的免疫治療中發揮越來越重要的作用，造福于醫學發展和人類健康。

（References）

［1］ Mazzarella L. Tales from the Jazz ASH： highlights from the 2013 American Society of Haematology meeting ［J］. E cancer medical science， 2014， 8： 390.

［2］ Grupp SA， Kalos M， Barrett D， et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia ［J］. N Engl J Med， 2013， 368 （16）： 1509-1518.

［3］ Kochenderfer JN， Rosenberg SA. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors ［J］. Nat Rev Clin Oncol， 2013， 10（5）： 267-276.

［4］ Chan JS， Yang YX， Han EQ， et al. Chimeric antigen receptor containing ICOS signaling domain mediates specific and efficient antitumor effect of T cells against EGFRvⅢexpressing glioma ［J］. J Hematol Oncol， 2013，6（1）： 33.

［5］ Lanitis E， Poussin M， Hagemann IS， et al. Redirected antitumor activity of primary human lymphocytes transduced with a fully human anti-mesothelin chimeric receptor ［J］. Mol Ther， 2012， 20（3）： 633-643.

［6］ Gross G， Waks T， Eshhar Z. Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1989， 86（24）： 10024-10028.

［7］ Ramos CA， Dotti G. Chimeric antigen receptor（CAR）-engineered lymphocytes for cancer therapy ［J］. Expert Opin Biol Ther， 2011， 11（7）： 855-873.

［8］ Kowolik CM， Topp MS， Gonzalez S， et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficiency of adoptively transferred T cells ［J］. Cancer Res， 2006， 66（22）： 10995-11004.

［9］ Pegram HJ， Lee JC， Hayman EG， et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning ［J］. Blood， 2012，119（18）： 4133-4141.

［10］ Chmielewski M， Hombach AA， Abken H. Of CARs and TRUCKs： chimeric antigen receptor（CAR） T cells engineered with an inducible cytokine to modulate the tumor stroma ［J］. Immunol Rev， 2014， 257（1）： 83-90.

［11］ Melenhorst JJ， Levine BL. Innovation and opportunity for chimeric antigen receptor targeted T cells ［J］. Cytotherapy，2013， 15（9）： 1046-1053.

［12］ Scheuermann RH， Racila E. CD19 antigen in leukemia and lymphoma diagnosis and immunotherapy ［J］. Leukemia&Lymphoma， 1995， 18（5-6）： 385-397.

［13］ Kochenderfer JN， Wilson WH， Janik JE， et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19 ［J］. Blood， 2010， 116（20）： 4099-4102.

［14］ Porter DL， Levine BL， June CH， et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia ［J］. N EngI J Med， 2011， 365（8）： 725-733.

［15］ Kochenderfer JN， Dudley ME， Kassim SH， et al. Chemotherapy-Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma and Indolent B-cell Malignancies Can Be Effectively Treated With Autologous T Cells Expressing an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor ［J］. J Clin Oncol， 2015， 33（6）： 540-549.

［16］ Ramos CA， Savoldo B， Liu E， et al. Clinical responses in patients infused with T lymphocytes redirected to target kappa-light immunoglobulin chain ［J］. BIOL BLOOD MARROW TR， 2014， 20（2）： S26.

［17］ Carpenter RO， Evbuomwan MO， Pittaluga S， et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma ［J］. Clin Cancer Res， 2013，19（8）： 2048-2060.

［18］ Wang Y， Zhang WY， Han QW， et al. Effective response and delayed toxicities of refractory advanced diffuse large B-cell lymphoma treated by CD20-directed chimeric antigen receptor-modified T cells ［J］. Clin Immunol， 2014， 155（2）：160-175.

［19］ Grupp SA， Kalos M， Barrett D，et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia ［J］. N Engl J Med， 2013， 368（16）： 1509-1518.

［20］ Brentjens RJ， Davila ML， Riviere I，et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia ［J］. Sci Transl Med， 2013， 5（177）： 177-38.

［21］ Lamers CH， Willemsen R， van Elzakker P， et al. Immune responses to transgene and retroviral vector in patients treated with ex vivo-engineered T cells ［J］. Blood， 2011，117（1）： 72-82.

［22］ Louis CU， Savoldo B， Dotti G， et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma ［J］. Blood， 2011， 118（23）：6050- 6056.

［23］ Morgan RA， Dudley ME， Wunderlich JR， et al. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes ［J］. Science， 2006， 314（5796）： 126-129.

［24］ Gargett T， Fraser CK， Dotti G， et al. BEAF and MEKinhibition variably affect GD2-specificchimeric antigen receptor（CAR） T-cell function in vitro ［J］. J Immunother，38（1）： 12-23.

［25］ Wang H， Wei H， Zhang R， et al. Genetically targeted T cells eradicate established breast cancer in syngeneic mice［J］. Clin Cancer Res， 2009， 15（3）： 943-950.

［26］ Maher J， Wilkie S. CAR mechanics： Driving T cells into the MUC of cancer ［J］. Cancer Res， 2009， 69（11）： 4559-4562.

［27］ Sasaki T， Ikeda H， Sato M， et al. Antitumor activity of chimeric immunoreceptor gene-modified Tc1 and Th1 cells against autologous carcinoembryonic antigen-expressing colon cancer cells ［J］. Cancer Sci， 2006， 97（9）： 920-927.

［28］ Zhong XS， Matsushita M， Plotkin J， et al. Chimeric antigen receptors combining 4-1BB and CD28 signaling domains augment PI3kinase/AKT/Bcl-XL activation and CD8+ T cell-mediated tumor eradication ［J］. Mol Ther，2010， 18（2）： 413-420.

［29］ Maus MV， Haas AR， Beatty GL， et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans ［J］. Cancer Immunol Res， 2013，1（1）： 26-31.

［30］ Morgan RA， Yang JC， Kitano M， et al. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2 ［J］. Mol Ther， 2010， 18（4）： 843-851.

［31］ 陳青，白定群.光化學轉染對腫瘤治療的研究進展［J］.世界復合醫學，2015，1（2）： 162-167.

［32］ 何紅晨，徐月萌，熊恩富，等.淺談國際康復醫學發展及啟示［J］.世界復合醫學， 2015， 1（2）： 130-133.

Nature：科學家首次發現抑郁癥相關基因

2014年2月，當牛津大學遺傳學家Jonathan Flint第一次發現某些基因序列和抑郁癥的發生有關時，他非常吃驚。因為進行這種嘗試的研究都相繼失敗，其中有研究從9000人重度抑郁癥篩選敏感基因，也有對17000人進行隨訪分析的研究。而他自己項目的研究規模只有5303人。該項目中國合作單位有復旦大學、華東師范大學和中國醫學科學院等。

但是Flint小組成功獲得了結果。最近他們發表2篇論文報道其中2個重度抑郁癥的基因標志。重度抑郁癥是嚴重危害人類健康的重要疾病。世界上有超過3.5億抑郁癥患者，抑郁癥的病情嚴重程度有很大差別，尤其是男女之間存在很大差別。這說明同樣的抑郁癥表現可能存在多種不同的遺傳背景。但是早期關于抑郁癥敏感基因的研究相繼失敗。Flint小組的發現將給尋找治療抑郁癥藥物的研究提供重要線索，也能開發更準確的診斷抑郁癥的重要工具。

分析結果發現了兩個抑郁癥相關突變部位，都位于10號染色體，一個突變位于SIRT1附近，另外一個是位于LHPP基因的一個內含子。LHPP基因是編碼一種目前功能不完全清楚的蛋白酶，另一個是SIRT1基因。SIRT1基因是線粒體內重要蛋白酶。與線粒體基因相關也符合過去的一些研究。過去研究發現抑郁癥和線粒體功能異常相關。線粒體功能異常會導致能量代謝功能紊亂，引起患者疲勞和興趣喪失。看來抑郁癥也是一種代謝性疾病，精神科醫生應該學習吸收內分泌科的知識。

斯坦福大學精神病學家Douglas Levinson 對這一研究的設計非常有興趣。他參與的Psychiatric Genomics Consortium曾經分析了17000抑郁癥患者的基因數據，竟然沒有發現抑郁癥相關基因，受這一研究啟發，他們將回頭對研究數據進行再分析，尤其是如果將重度抑郁癥單獨分析，或許能有新的發現。

如果是這樣，應該采集更多樣本，尋找確認更多與抑郁癥相關的基因。Levinson預計，未來5年內英國、荷蘭和澳大利亞已經建立生物樣本庫的機構將可提供大規模的基因組分析數據，利用這些數據將能發現更多有價值的抑郁癥相關基因，根據這些相關基因，將能幫助開發出真正具有針對性的抑郁癥治療藥物，也將協助抑郁癥的診斷和預測的基因手段。

Flint團隊的成功將促進這一研究領域。這一研究也非常值得思考，關于抑郁癥基因的研究，許多人認為這是愚蠢的研究，抑郁癥不可能與基因有關，如果不堅持自己的設想，繼續努力，這一研究可能早就放棄了。因此，選擇了方向，就要堅持下去。做研究就要有不怕被別人恥笑的精神。

Research progress of chimeric antigen receptor-modified t lymphocytes in tumor immunotherapy

ZHAO Yuanyuan， KONG Ning， WANG Yi
School of Pharmaceutical Sciences， Jilin University， Changchun 130021

In recent years， as a novel tumor immunotherapy technology， chimeric antigen receptor（CAR）—modified T lymphocyte has made great achievements in immunotherapy technology for the treatment of malignant tumors， which has brought hope of recovery for part advanced patients. CAR is a kind of novel genetically engineered receptor which combines the antigen-binding region with the intracellular signal transduction region by genetic engineering technology. CAR- modified T Lymphocytes can kill tumor cells by means of non-MHC restriction. In this article， we highlight the applications of the CAR-T in the treatment of malignant tumor in recent years， and elaborate the development prospect in the future.

chimeric antigen receptor （CAR）； T lymphocyte； tumor； immunotherapy

R730.51

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.11

2015-07-25；

2015-08-26

吉林省科技廳青年基金（20130522011JH）

趙媛媛，碩士研究生，研究方向為腫瘤疫苗，電子信箱：zyy100390@163.com；王毅（通信作者），博士，教授，博士生導師，研究方向為腫瘤疫苗，電子信箱： wangyi@jlu.edu.cn

引用格式：趙媛媛，孔寧，王毅.嵌合抗原受體T細胞在腫瘤免疫治療中的研究進展［J］.世界復合醫學，2015，1（3）：247-251