臨床微生物的快速診斷的方法學(xué)研究進(jìn)展

王秀媛綜述，劉玉英審校

(寶坻中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 301800)

1 直接臨床標(biāo)本的檢測

1.1 直接從臨床標(biāo)本中檢測病原體成分及抗原應(yīng)用單克隆抗體結(jié)合各種形式的標(biāo)記技術(shù)可以檢出臨床標(biāo)本中痕量的微生物抗原，免去細(xì)菌或病毒培養(yǎng)的過程，直接完成微生物感染的快速診斷。如應(yīng)用斑點(diǎn)酶免疫測定(EIA)、熒光免疫試驗(yàn)(FIA)或金標(biāo)法檢測淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、肺炎支原體，快速、直觀[1]；針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的表面抗原或脂阿拉伯聚糖(GMA)制成單抗，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或斑點(diǎn)酶免疫測定(EIA)直接檢測標(biāo)本中的TB抗原[2]，Hillemann等用CapiliaTB產(chǎn)品檢測結(jié)核分枝桿菌MPB64抗原，在172例結(jié)核桿菌陽性的臨床標(biāo)本的檢測中陽性檢出率為97%，特異性達(dá)100%；直接檢測糞便中的O157：H7大腸埃希菌抗原，Takeda等用膠體金免疫層析條直接檢測水樣便中的EHEC O157，報(bào)道檢測限為5×l05cfu／ml，與培養(yǎng)法相比一致率為89.10%，與ELISA法相比一致率為87.2%，但膠體金免疫層析法用時(shí)僅5min[3]；又如直接檢查糞便中的幽門螺桿菌抗原(HpSA),2004年國內(nèi)文獻(xiàn)關(guān)于HpSA免疫快檢卡診斷HP感染的首次報(bào)道，其敏感性為92.6%．特異性為88.5%．總的檢測準(zhǔn)確性為90.6%[4]，該方法適用于幽門螺桿菌感染的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷,也適用于HP的根除療效觀察和隨訪復(fù)查，更適用于老年于老人、兒童、孕婦及不宜做胃鏡檢查的患者，臨床實(shí)驗(yàn)室可以把HpSA檢測作為HP感染的常規(guī)檢查項(xiàng)目,值得在臨床實(shí)施和推廣[5，6]；美國BinaxNow肺炎鏈球菌抗原檢測試劑盒可直接用于尿液和腦脊液標(biāo)本的檢測，用于肺炎球菌性肺炎和肺炎球菌性腦膜炎的診斷；還有采用各種不同載體如聚苯乙烯粒子(Latex)、明膠粒子、碳末、含蛋白A的金黃色葡萄球菌、膠體金等制成凝集試劑，直接測定糞便標(biāo)本中的輪狀病毒、腦脊液中的腦膜炎奈瑟菌、B型流感桿菌，以及鏈球菌的分群(A、B、C、D 等群)等。

真菌的檢測，通過檢測真菌細(xì)胞壁的β-1,3葡聚糖 (G試驗(yàn))，β-1,3葡聚糖在有些真菌細(xì)胞壁>50%，用動(dòng)態(tài)濁度法來檢測，可檢測念珠菌、毛孢子菌、曲霉、鐮刀霉、支頂孢霉、卡氏肺孢子菌，可用于以上真菌的早期診斷和動(dòng)態(tài)反應(yīng)感染程度及抗真菌治療效果[7]，研究顯示敏感性和特異性分別為(63%~100%)和(74%~100%)，缺陷在于容易引起假陽性，而且無法區(qū)別真菌種類[8]；半乳甘露聚糖(GM試驗(yàn))試驗(yàn)，半乳甘露聚糖是曲霉菌細(xì)胞壁成分，菌絲在生長過程中釋放，曲霉菌、隱球菌、青霉/擬青霉GM試驗(yàn)陽性，GM試驗(yàn)其靈敏度可達(dá)1ng/ml,ELISA檢測血清中半乳甘露聚糖用于診斷曲霉具有良好的敏感性 (64.5%~100%)和特異性 (80%~98.7%)，可以用于曲霉的早期診斷和治療監(jiān)測；在臨床試驗(yàn)中可通過G+GM試驗(yàn)對(duì)不同感染的真菌進(jìn)行檢測可提高試驗(yàn)準(zhǔn)確度[9-11]。

1.2 檢查某些細(xì)菌的專有酶進(jìn)行快速鑒定 已發(fā)現(xiàn)某些具有特征性的酶，應(yīng)用適當(dāng)?shù)牡孜锟裳杆偻瓿杉?xì)菌鑒定。如沙門菌具有辛酸酯酶，以4MU-辛酸酯酶為底物，經(jīng)沙門菌酶解，在紫外燈下觀察游離4MU的熒光，國內(nèi)已有應(yīng)用[12]；卡他莫拉菌具有丁酸酯酶，可用丁酸酯酶色原底物快速鑒定；大腸埃希菌具有β-葡萄糖醛酸酶，但以O(shè)157：H7為代表的腸出血性大腸埃希菌(EHEC)卻不具此酶，故葡萄糖醛酸酶陰性以成為初步篩查EHEC的重要特征[13]；白念珠菌具有脯氨酸肽酶及N-乙酰β-D半乳糖苷酶，分別以適當(dāng)?shù)牡孜餀z測試驗(yàn)只需20min，兩酶陽性為白念珠菌；難辨梭菌具谷氨酸脫氫酶(GDH)，應(yīng)用此酶的IgG抗體(兔抗GDH)包被固相檢測卡，應(yīng)用雙抗體夾心法檢測糞便中的GDH[14，15]等。

1.3 快速檢出細(xì)菌的毒素 自臨床標(biāo)本中直接檢出細(xì)菌的毒素，常比細(xì)菌培養(yǎng)更可靠。已應(yīng)用難辨梭菌的單抗以快速凝集或EIA法自糞便標(biāo)本中直接檢出毒素A或B進(jìn)行診斷[16]；產(chǎn)毒素埃希菌(ETEC)感染的診斷主要依靠查細(xì)菌的熱敏毒素(LT)與耐熱毒素(ST)可應(yīng)用其單抗以多種免疫學(xué)手段檢出；應(yīng)用反向被動(dòng)乳膠凝集發(fā) (Oxoid公司試劑)快速檢測葡萄球菌的毒性休克綜合征毒素-I(TSST-I),可及時(shí)診斷出球菌所致的中毒性休克綜合征。

1.4 檢測機(jī)體對(duì)感染的免疫應(yīng)答 正常情況下，細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌受機(jī)體的嚴(yán)格的調(diào)控，在炎癥的情況，某些細(xì)胞因子的表達(dá)量可成百上千倍的增加。如白細(xì)胞介素(IL-6、IL-10、TNF-α)在炎癥時(shí)可快速上升，且半衰期很短，可作為急性感染的早期輔助診斷；C反應(yīng)蛋白(CRP)可用于細(xì)菌和病毒感染的鑒別診斷，一旦發(fā)生炎癥，CRP水平即升高，而病毒感染CRP大都正常，膿毒血癥CRP迅速升高，而依賴血培養(yǎng)至少需要48h，且其陽性率不高，又如CRP能快速有效地檢測細(xì)菌性腦膜炎，其陽性率達(dá)99%；降鈣素原(PCT)在細(xì)菌性感染時(shí)3~4h即可升高，半衰期接近24h，能快速反饋治療成效(每24h降低50%的濃度)，PCT反映感染的嚴(yán)重程度，健康者一般低于0.05ng/ml,局部感染在0.05~0.5ng/ml之間，全身性感染在0.5~2.0ng/ml，嚴(yán)重感染膿毒癥一般在2-10ng/ml,而膿毒癥休克>10ng/ml，根據(jù)PCT的測定值可以反映抗生素的治療療效，如PCT值在應(yīng)用抗生素或更改抗生素后測定值持續(xù)下降，說明治療是有效的，對(duì)細(xì)菌的感染診斷具有高特異性，可以改善臨床診斷，血液中的水平快速升高，半衰期超過24h，隨著疾病的進(jìn)展和加重水平持續(xù)升高，感染有效控制后水平快速下降，有效指導(dǎo)抗生素的使用，檢測方法方便，體內(nèi)外穩(wěn)定性高，不受糖皮質(zhì)激素的影響，結(jié)合臨床背景進(jìn)行個(gè)體化診斷和治療[17]；γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞,效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子(IFN-γ)，有研究實(shí)驗(yàn)該方法敏感性為96.1%，特異性為95%;T-SPOT.TB是較靈敏和特異的快速檢測結(jié)核分枝桿菌感染的方法[18]，因此檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染者的診斷，由于效應(yīng)T淋巴細(xì)胞存活時(shí)間很短，而且具有特異性，因此可作為機(jī)體是否正處于被感染者的指標(biāo)[19]。

2 細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏的快速試驗(yàn)

一系列的商品化的顯色培養(yǎng)基進(jìn)入臨床微生物實(shí)驗(yàn)室，將標(biāo)本直接接種所需的不同要求的顯色培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，大大縮短了臨床致病菌的檢測和鑒定時(shí)間還能降低實(shí)驗(yàn)室成本。如大家比較關(guān)注的艱難梭菌顯色培養(yǎng)基、真菌顯色培養(yǎng)基等[20]；還可以根據(jù)培養(yǎng)基生長的菌落顏色變化可判讀是否為耐藥菌株，如MRSA、ESBL、VRE、等培養(yǎng)基，比傳統(tǒng)方法至少節(jié)約時(shí)間1~2d[21-23]；Nitrocefin紙片法可以快速檢測培養(yǎng)出的革蘭陽性球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌的β-內(nèi)酰胺酶；快速鑒定MRSA和MRCNS的快速乳膠凝集試驗(yàn)(日本生研公司)可檢出親和力降低的青霉素結(jié)合蛋白 (PBP2a)[24]；BBL公司的MGIT(Mycobacterial Growth Inhibitor Tube)于結(jié)核桿菌TH9培養(yǎng)中加入異煙肼、利福平等藥物及熒光指示劑，在365nm的紫外燈下觀察有無熒光而判斷敏感或耐藥，試驗(yàn)僅需4~5h，從而實(shí)現(xiàn)快速結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)；Jacobs等將熒蟲酶的基因?qū)虢Y(jié)核桿菌的噬菌體，噬菌體只侵入活的結(jié)核桿菌而發(fā)出熒光，將菌體與一定濃度的藥物作用后，如菌體存活則感染噬菌體，可在熒光顯微鏡下觀察到熒光，即為耐藥，無熒光者為敏感。

近十幾年來，病原微生物的快速診斷方法發(fā)展很快，ELISA快速檢測抗原及抗體技術(shù)已被普遍的應(yīng)用，簡化了過去繁瑣的微生物學(xué)的檢測手續(xù)，特別是采用單克隆抗體，進(jìn)一步提高了檢測的特異性和敏感性。目前已制備出許多診斷試劑盒，其中病毒的快速診斷試劑盒的廣泛應(yīng)用，使過去長期難以實(shí)現(xiàn)的病毒病的快速實(shí)驗(yàn)診斷成為現(xiàn)實(shí)。自動(dòng)免疫分析儀的誕生，為感染性疾病的血清學(xué)診斷提供了許多簡便、快速、靈敏和特異的新手段。20世紀(jì)90年代，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸雜交技術(shù)、基因測序和PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用，使某些不能培養(yǎng)、培養(yǎng)需很長時(shí)間和需特殊培養(yǎng)條件的微生物引起的感染性疾病的基因診斷成為可能[25-28]。隨著新技術(shù)發(fā)展的日新月異，大大提高了醫(yī)學(xué)微生物學(xué)檢驗(yàn)診斷水平及效率。

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