病理石蠟標本基因檢測中D N A提取(離心柱型)的幾點體會

陳順平，蘇海燕，吳文喬

(福建醫科大學附屬漳州市醫院病理科，福建 漳州363000)

隨著分子生物技術在臨床中開展，其所覆蓋的檢測疾病的范圍越來越廣，不僅在常規醫學檢驗中，近年來隨著臨床靶向治療的普及，病理腫瘤標本的相關基因檢測也得到發展。然而，什么樣的病理標本適合做基因檢測？怎么才能夠得到更多更好的DNA呢？是目前我們病理科開展此項目所面對的問題。經過我們不斷實踐，現將幾點體會介紹如下。

1 標本及時合適的固定是石蠟標本基因檢測的關鍵步驟

活組織或脫落細胞應得到及時且合適固定液固定，一般活組織離體30 min內凍存或10%中性緩沖福爾馬林固定，脫落細胞應及時離心，-80℃保存或用棉絮紙包裹，按組織常規處理。合適固定液及時固定可以大大降低DNA的降解，減少基因的片段化，同時避免使用含重金屬固定液，如Bouin液等。若標本固定不佳，在后期的標本制備過程則無法加于糾正。臨床送檢組織標本時間與固定后標本取材時間之差最好統一，一般為6～48 h為好[1,2]。活檢小標本一般為6～12h，組織大標本為6～48h且按要求剖開固定，保證標本充分固定，有效保護細胞中DNA質量，提高DNA提取效率，保證檢測結果的可靠性。

2 足夠的腫瘤細胞是石蠟標本基因檢測的必備要求

足夠的腫瘤細胞是基因檢測DNA提取的基本條件，也是必備要求。在挑取腫瘤組織蠟塊時，應充分地考慮腫瘤細胞數量、組織類型及避開壞死組織等。在提取標本DNA時一般應首先進行病理評估，了解腫瘤細胞的數量、腫瘤細胞百分比及組織類型，如達不到病理評估的要求則應終止下游基因檢測，符合要求進行下游檢測。實際過程中我們可在切取病理石蠟標本做DNA提取時切一張白片用于HE染色于判斷腫瘤百分比及腫瘤細胞數。如該標本已行免疫組化檢測時不能將用于常規病理診斷的HE染色制片中腫瘤細胞分布情況用于病理評估，在切取標本提取DNA時再切一張白片用于染色，以免免疫組化檢測后腫瘤細胞數量不足，特別是活檢小標本。腫瘤細胞含量的最小比例應由不同檢測方法的敏感度決定，專家共識認為要求腫瘤細胞數一般要求大于200個，且腫瘤細胞應占整張切片所有細胞10%以上[2]。實際操作中應盡量刮取腫瘤細胞豐富的區域且避開壞死或紅細胞較多的區域用于DNA的提取，可以提取到高質量相關DNA，特別是測序技術，同時可降低PCR擴增抑制物的存在。手術根治標本是我們病理基因檢測的最好標本，腫瘤細胞較多、含量比例高。相反，活檢小標本一般腫瘤細胞數偏少。如腫瘤細胞數量不夠，可多切組織切片彌補腫瘤細胞不足，但應保證腫瘤細胞占整張切片所有細胞10%以上，如腫瘤細胞所占比例小于10%，組織標本應脫蠟后切除無關細胞已達到要求，這樣腫瘤細胞提取相關DNA質量仍好。同時應對病理評估結果做好記錄，方便與DNA提取結果進行比較，累積經驗。

3 D N A提取是石蠟標本基因檢測的前提條件

3.1 標本的選擇 一般選擇病理組織蠟塊保存時間越短越好。組織標本經過福爾馬林固定，可引起組織蛋白與核酸交聯反應。石蠟組織標本保存時間越長，核酸片段化越嚴重，加劇核酸甲基化修飾，核酸提取質量越差，濃度偏低[3]。保存時間長的標本切片時應盡量切掉與空氣接觸的外層組織再切取組織進行DNA提取，特別是未行封蠟的組織蠟塊。

3.2 標本的處理 石蠟標本在進行切片前，應將切片機清潔干凈，可用75%乙醇消毒臺面及鑷子等。每個標本應選擇一個刀口，嚴格控制標本間交叉污染。手術根治標本最好選擇5μm～10μm切片黏附載玻片上，脫蠟完后用手術刀轉移組織，簡便、省時；而活檢小標本可以選擇EP管收集連續切片，管內脫蠟，達到盡可能收集腫瘤細胞。在進行組織切片時不建議厚度超過10μm或低于5μm，過厚組織切片會增加脫蠟的困難，也增加細胞酶消化和裂解的難度；過薄則容易產生DNA斷裂。如選擇EP管二甲苯脫蠟時乙醇去除二甲苯后，應晾干方可進入下一步驟，殘存有機溶劑會降低提取率及后續擴增效率。對于EP管脫蠟，應關注EP管底至少有肉眼可見的樣本存在，以保證足夠DNA用于下游檢測。

3.3 DNA的提取 DNA提取一般情況下應嚴格按照本實驗室的SOP文件執行，然而在實際操作過程中往往要對不同情況進行針對性處理，才能獲得比較滿意的結果，筆者歸納如下。

3.1 酶及裂解 實驗中標本消化一般用蛋白酶K，其濃縮粉末可室溫15~30℃保存，分裝完應放入-20℃保存。DNA提取操作中首先溫度設定為56℃蛋白酶K的消化及裂解過程，最佳工作消化時間視標本而定，不同的標本一般不一樣[4]。過量的標本含量將影響酶的消化及裂解效果，標本含量越多消化及裂解時間應越長，酶消化完成后應檢查酶消化效果，如還有很明顯的組織漂浮物應說明樣本加入量偏大應適度延長酶消化時間。適量加大酶量或延長消化時間有助于加強消化裂解作用[5,6]。蛋白酶K消化一定要滿足DNA釋放完全有效，保證以滿足后續實驗需要DNA的量[7]。蛋白酶K消化裂解后進入90℃滅活，此階段裂解液對修飾DNA及釋放DNA進一步發揮作用。

3.2 DNA洗滌 DNA洗滌液使用前按要求加入無水乙醇，使其成為合格的DNA洗滌液，否則造成DNA柱上流失，大大降低其濃度。DNA洗滌時將洗滌液靜置時間應嚴格控制，保證洗滌液與核酸有充分的反應時間，提高標本DNA洗滌效果。

3.3 DNA洗脫 洗脫液pH不合適，將會減少DNA提取效率，應確保洗脫液pH值在7.0～8.5之間。為了提高DNA洗脫效率，可在加入洗脫液后在室溫靜置至少3min以上，腫瘤細胞偏少應5min以上，再按要求離心。加入洗脫液量可根據我們病理評估及基因檢測要求量的結果適度加減，超過200μl洗脫體積所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少。建議活檢小標本DNA洗脫液體積應小于 100μl。

4 D N A定量

提取的DNA應經過定量以保證足夠適量的DNA含量用于下游突變檢測。DNA提取后應立即進行DNA濃度測定，隨后存儲DNA樣本。可利用分光光度計在260nm處光密度值和銀光染料法DNA總量檢測，OD260nm/OD280nm比值可直觀判斷基因的純度，一般值為1.8～2.0較好，該方法較簡便，但無法評估可擴增的DNA片段和PCR抑制物。若DNA含量的確不符合檢測要求應終止進一步檢測，以節約成本和時間。

綜上所述，在病理石蠟標本基因檢測DNA提取中，我們應盡量了解每個步驟的作用以及學會如何控制石蠟標本DNA提取的關鍵點，這是對石蠟標本基因檢測的操作者必備要求，也是如何防止假陽性假陰性結果的出現而采取了質量保證措施，同時也是我們病理科開展基因檢測項目前提[8]。

[1]中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家組.中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識[J].中華病理學雜志,2011,40(10):700-702.

[2]衛生部病理質控與評價中心,結直腸癌KRAS基因突變檢測專家組.中國結直腸癌KRAS基因突變檢測專家共識[J].中華病理學雜志,2012,41(9):635-636.

[3]李丹,劉亞麗,劉靜,等.石蠟組織存放時間對提取DNA質量的影響[J].河南大學學報(醫學版),2014,33(1):9-13.

[4]陳順平.FISH中酶消化細胞的幾點體會[J].臨床與實驗病理學雜志,2010,26(1):116-117.

[5]Sengüven B,Baris E,Oygur T，et al.Comparison of methods for the extraction ofDNA from formalin-fixed,paraffin-embedded archival tissues[J].Int J Med Sci,2014,11(5):494-503.

[6]王卡娜,李紅芳,楊愛宏.等.石蠟包埋組織中DNA提取方法的比較[J].中國實驗診斷學,2009,13(6):753-756.

[7]張玲玲,劉月平,王永軍,等.石蠟包埋組織基因組DNA提取的條件優化[J].臨床與實驗病理學雜志,2011,27(9)：1021-1023.

[8]李金明.實時熒光PCR技術[M].北京:人民軍醫出版社,2009:383.