瘋草毒素-苦馬豆素降解菌降解特性的研究

王曉全

(陜西省渭南市澄城縣家畜改良站,陜西渭南 715200)

瘋草毒素-苦馬豆素降解菌降解特性的研究

王曉全

(陜西省渭南市澄城縣家畜改良站,陜西渭南 715200)

從瘋草生長環(huán)境中的土壤中分離到8株細菌。其中1號菌接種量為5%時可以在12h內(nèi)將含量為50 mg/L的苦馬豆素降解,降解率達99%以上。降解的最佳溫度為30℃,最佳pH為7,1mol/L的Mg2+可以提高該菌株對苦馬豆素的降解率;而1mol/L的K+ 對其降解苦馬豆素有明顯的抑制作用。1g/L的葡萄糖對其降解有明顯抑制作用。1g/L 淀粉有促進作用,乳糖、甘露醇作用不明顯,蔗糖的抑制作用不明顯。降解的速率與苦馬豆素的含量有關(guān),接種細菌量與降解速率成正相關(guān)。

瘋草;苦馬豆素;生物降解

瘋草（locoweed）是棘豆屬（Oxytropis）和黃芪屬（Astragalus）兩屬植物的統(tǒng)稱，全世界約有2000余種，分布于美國、俄羅斯、澳大利亞、加拿大、墨西哥、和冰島等國家。在我國主要分布于甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆、陜西、四川、寧夏和西藏等省（區(qū)）的草原、山地和荒漠，危害、面積超過1100萬平方公頃，占全國草場面積的2.8%。瘋草具有很強的適應能力，對草原畜牧業(yè)危害大，主要包括：造成牲畜死亡、影響牲畜繁殖、妨礙牲畜改良、促使草場退化等，給草原畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-4]。

苦馬豆素是瘋草的主要有毒成分。國外獸醫(yī)毒理學家根據(jù)瘋草對動物毒性作用的不同，將瘋草有毒成分分為三大類：脂肪族硝基化合物、硒及硒化合物、瘋草毒素。探索一條苦馬豆素生物降解的途徑，篩選出能降解苦馬豆素的微生物，研究其對苦馬豆素的降解特性，深入探討生物降解的分子機理，并將這些研究成果應用于生長實踐中。

近年來，應用微生物降解毒物、毒素一直是國內(nèi)外研究的熱點，涉及的領域十分廣泛。微生物降解是生物最古老的功能之一，對物質(zhì)的降解能力上看，其化學活性幾乎是萬能的，因此自然界中幾乎所有的有機化合物都可在自然條件下被微生物降解[5]。本實驗室通過對瘋草生長區(qū)土壤分析，分離篩選出12株能降解瘋草毒素之一四甲基哌啶酮（TMPD）的菌株，建立了微生物降解TMPD的有效方法；其中4株降解率分別達到82.54%、71.24%、68.20%和66.69%，對草原毒草的生物學控制和草原生態(tài)學研究起到積極作用[4-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

變異黃芪：2000年采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善左旗。土樣：瘋草生長環(huán)境周圍的土壤。

1.2 方法

1.2.1 苦馬豆素提取

稱取1.5 kg變異黃芪和10 L蒸餾水放在超聲清洗器中浸漬12 h，然后用超聲波50 ℃處理1 h，更換溶媒并在相同條件下重復1次，收集得水提液加熱濃縮至2 L，除去固體雜質(zhì)，然后在水浴鍋上繼續(xù)濃縮至1 L；加入適量氨水調(diào)pH至8～10，萃取此濃縮液；用稀硫酸萃取；再用1～2 L氨性氯仿萃取；濃縮氨性氯仿萃取液得浸膏；最后浸膏在-0.09 MPa 條件下石蠟油浴中進行升華。

1.2.2 氣相色譜法檢測苦馬豆素

將取得的樣品冷凍干燥，每管加145 μl吡啶，80 μl甘露糖甙溶液，25 μl（BSTFA＋TMCS）。反應30 min，氣相色譜儀檢測苦馬豆素含量，收集數(shù)據(jù)計算降解率。

1.2.3 降解菌的分離

（1）富集選擇培養(yǎng)篩選法

將采于瘋草生長環(huán)境的土樣作為篩選菌株的來源，進行降解菌的篩選。將土樣用無菌水制成菌懸液，以10%的接種量接種于富集培養(yǎng)夜，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48h后，按10%的接種量接種于含SW 30 mg/L的富集培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2 d后再以10%接種量接種于新鮮的含SW50 mg/L的富集培養(yǎng)液中，以后每隔4 d移種一次，并逐漸增加SW含量，當SW濃度為200 mg/L時，對長出的菌落用平板劃線法進行分離純化。

（2）平板分離

挑取生長在SW為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基上的菌落，涂布于牛肉蛋白胨平板，反復劃線純化，保存于4 ℃。

1.2.4 不同外界條件對降解菌降解能力的影響

（1）不同培養(yǎng)時間對降解能力的影響

以5%的接種量將1號菌接種到含有50 mg/L苦馬豆素的無機鹽培養(yǎng)液中，搖動培養(yǎng)，設3個重復，以不接菌的SW無機鹽培養(yǎng)液為對照，每隔2 h取樣。將樣品凍干后用氣相測定法測定苦馬豆素的含量，計算降解率。

（2）不同pH對降解能力的影響

以5%的接種量將1號菌接入到不同pH的含50mg/L苦馬豆素的無機鹽培養(yǎng)基中，設3個重復，以不接菌的SW無機鹽培養(yǎng)液為對照，每隔3 h取樣。將樣品凍干后用氣相測定法測定苦馬豆素的含量，計算降解率。

（3）不同溫度對降解能力的影響

以5%的接種量將1號菌接入到含有50 mg/L苦馬豆素的無機鹽培養(yǎng)液中分別20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，設3個重復，以不接菌的SW無機鹽培養(yǎng)液為對照，每隔2 h取次樣。將樣品凍干后用氣相測定法測定苦馬豆素的含量，計算降解率。

（4）苦馬豆素初始濃度對降解的影響

分別在含0.5%、1%、5%、10%、20%苦馬豆素的無機鹽培養(yǎng)液中加入1號菌使其含量為50 mg/L，30℃，2 h取樣一次。將樣品凍干后用氣相測定法測定苦馬豆素的含量，計算降解率。

（5）不同接菌量對降解能力的影響

以5%的接種量將1號菌接入到含有200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、30 mg/L、10 mg/L苦馬豆素的無機鹽培養(yǎng)液中，設3個重復，以不接菌的SW無機鹽培養(yǎng)液為對照，2 h取樣一次。將樣品凍干后用氣相色譜法測定苦馬豆素的含量，計算降解率。

（6）金屬離子對降解能力的影響

分別在含5%1號菌和50 mg/L苦馬豆素的無機鹽培養(yǎng)液中加入MgSO4、KNO3使離子濃度為1 mol/L，設3個重復，以不接菌的SW無機鹽培養(yǎng)液為對照，將樣品凍干后用氣相測定法測定苦馬豆素的含量，計算降解率。

（7）其他營養(yǎng)物質(zhì)對降解的影響

將葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇加入到含50 mg/L苦馬豆素中使這些物質(zhì)含量為10 g/L，搖床培養(yǎng)，設3個重復，以不接菌的SW無機鹽培養(yǎng)液為對照，每3h取樣一次。將樣品凍干后用氣相測定法測定苦馬豆素的含量，計算降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離

按照1.2.2方法共分離出8株菌其中1號菌可以對苦馬豆素進行很好的降解。

2.2 不同時間培養(yǎng)對降解能力的影響

按1.2.4（1）的方法，苦馬豆素在12個小時內(nèi)已被完全已經(jīng)完全降解。

2.3 pH對降解能力的影響

按1.2.4（2）的方法，pH7為苦馬豆素降解的最佳pH，堿性條件優(yōu)于酸性條件。

2.4 不同溫度對降解能力的影響

按1.2.4（3）的方法，降解的最佳的溫度為30℃。

2.5 苦馬豆素初始濃度對降解的影響

按1.2.4（4）的方法，苦馬豆素的初始濃度越低降解完所用時間越短，苦馬豆素初始濃度越高降解完所用時間越長。

2.6 不同接菌量對降解能力的影響

按1.2.4（5）的方法，1號菌的接種量與降解率成正相關(guān)。

2.7 金屬離子對降解能力的影響

按1.2.4（6）的方法1mol/L k+降解有抑制作用，1mol/L mg2+對降解有促進作用。

2.8 其他營養(yǎng)物質(zhì)對降解的影響

按1.2.4（7）的中的方法，1號菌在降解苦馬豆素時加入葡萄糖對其降解有抑制作用且較為明顯。而淀粉有促進作用乳糖、甘露醇作用不明顯，蔗糖有抑制作用但不明顯。

3 結(jié)論

從瘋草生長環(huán)境周圍的的土壤中分離出來的8株菌中的1號菌在溫度30℃、pH7情況下降解苦馬豆素效果最佳；苦馬豆素的初始濃度越高降解越慢，越低降解越快；1號菌的種量與降解速率成正相關(guān)；金屬離子的存在對降解影響較大，1mol/L k+降解有抑制作用，1mol/L mg2+對降解有促進作用；低濃度其他營養(yǎng)物質(zhì)對降解有影響，葡萄糖對其降解有抑制作用且較為明顯。而淀粉有促進作用乳糖、甘露醇作用不明顯，蔗糖有抑制作用但不明顯。

[1] 李柞煌，關(guān)亞農(nóng)，楊桂云，等.醉馬草（小花棘豆）中毒的調(diào)查和有毒成分的研究[J].內(nèi)蒙古畜牧獸醫(yī)，1978，（1）：1-18.

[2] 李建科，楊具田，潘和平，等.家畜黃花棘豆、甘肅棘豆中毒的調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科技，1987，（5）：22-23.

[3] 王建華，張志恒，高巨星.西藏阿里地區(qū)動物“醉馬草”中毒病調(diào)查報告[J].動物毒物學，1998，13（1-2）：22-27.

[4] 李勤凡.冰川棘豆的毒性及降解菌的研究[D].西北農(nóng)林科技大學，2005.

[5] 張浩，劉緒川.瘋草中毒研究概況及其進展[D].中國農(nóng)業(yè)科學院中獸醫(yī)研究所，730050.