牛病毒性腹瀉的檢疫

王貴波 冷雪秋

(吉林省通榆縣動物檢疫站,吉林通榆 137200)

牛病毒性腹瀉的檢疫

王貴波 冷雪秋

(吉林省通榆縣動物檢疫站,吉林通榆 137200)

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起牛的一種接觸性傳染病,也稱黏膜病(MD)。該病以黏膜發炎、糜爛、壞死和腹瀉為特征。

牛病毒性腹瀉;檢疫;中和試驗

1 流行病學

本病主要是消化道感染，也經由呼吸道感染。病毒可以通過胎盤發生垂直感染。家養和野生的反芻獸及豬是本病的自然宿主，自然感染見于各品種牛，無明顯的種間差異。各種年齡的牛對本病均易感，尤以6～18個月齡的育成牛發病率較多。本病常年發生，多見于冬季和早春，舍飼和放牧牛都可發病。封閉式牛群中更易集中爆發本病。

2 活體檢疫

本病自然感染的潛伏期為7～10d，短者為2d，長者為14d。人工感染的潛伏期多為2～3d。臨床上癥狀輕的為亞臨床感染，嚴重的為暴發性致死。急性型：青年牛易發生急性感染，在臨床上可呈隱性或發生腹瀉。多表現為突然發病，體溫升高達40～42℃，持續2～3d，有的呈二次升高。精神高度沉郁，厭食，有的病牛常見心率加快，呼吸急促或劇烈干咳。腹瀉常為水樣，一般于發熱后2～4d，糞有惡臭，含有黏液及血液。口腔黏膜出現糜爛，之后糜爛融合并壞死。有的病畜康復快，黏膜損害在10～14d內痊愈。慢性型：目前認為慢性BVD和MD是持續感染的繼續，正常牛不發生這兩種疾病過程。

3 血清學診斷

習慣用細胞中和試驗和瓊脂擴散試驗檢測抗體。雖然在不同毒株之間存在較高程度的交叉反應，但在細胞培養物中的病毒中和試驗確實可以反映不同毒株的某些特征。瓊脂擴散則完全是群特異性的，不能鑒別毒株。

3.1 中和試驗

（1）材料準備：①病毒：采用Oregen C24毒株，按常規方法在犢牛腎、睪丸或鼻甲骨細胞上繁殖，待75%細胞出現典型病變收毒，凍融3次，測定毒價，分裝于小瓶內低溫保存。②細胞：采用犢牛原代腎細胞、睪丸細胞、鼻甲骨細胞或MDBK細胞。③培養液：采用MEM，生長液中加10%犢牛血清，維持液中加2～5%犢牛血清，培養基pH值為7.0～7.2，可加100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。④被檢血清：無菌靜脈采血，分離血清，并于56℃滅活30min。⑤微量細胞培養板：進口的96孔板可直接使用，國產板須按常規洗滌、紫外線消毒2～3h后使用。⑥加樣器：單頭或多頭的50～200μl可調加樣器。

（2）操作程序：①定量試驗：首先用多頭加樣器于96孔板每孔中加稀釋液50μl，再取滅能的被檢血清加入微量板的第一排孔中，每份樣品點4個孔，每孔50μl。用多頭加樣器（調至50μl）從第一排孔連續稀釋到最后一排孔，從最后一排孔中棄去50μl。然后用稀釋液將病毒稀釋成含100 TCID50/50μl的工作液，用多頭加樣器于第二排以下各孔中加病毒工作液50μl，第一排孔中加50μl稀釋液作為血清對照。之后加蓋于37℃，5%CO2培養箱中中和1h，于各孔中加100μl細胞懸液（將生長良好的單層細胞用EDTA-胰酶消化液消化分散后用含20%犢牛血清的培養液配制成含40萬/ml的細胞懸液），置37℃，5%CO2培養6d，從第四天開始觀察結果，于第六天最終判定。試驗均需做病毒回歸、陰性血清、陽性血清和正常細胞對照。病毒回歸對照是以含有100 TCID50/50μl病毒為原液，用稀釋液做3次10倍遞進稀釋。取病毒工作液和3個稀釋度的病毒來做滴定，每個滴度加4個孔，每孔再加50μl稀釋液和100μl細胞懸液。②定性試驗：除了將血清做一個稀釋度即1：5稀釋外，其他步驟同定量試驗方法。

（3）結果判定：試驗后第四天開始觀察判定，并于第六天終判，對照細胞孔內細胞單層良好，病毒用量為100 TCID50/50μl（50～500 TCID50/50μl范圍內均可認為試驗成立），陽性血清對照孔不出現細胞病變，陰性細胞孔出現細胞病變方可進行結果判定。

判定標準：定量試驗中，根據所得結果按Karber計算50%保護量（PD50）即為該血清的中和效價。其中PD50=L＋d（S-0.5），L為病毒最低稀釋度的對數，d為稀釋系數，S為死亡（感染）比值的和。定性試驗中，每份被檢血清在1：5稀釋度時有2個或2個以上孔的細胞完全被保護，該血清即為陽性。

3.2 瓊脂擴散試驗

瓊脂擴散試驗只能粗略測定被檢血清中的抗體，其敏感性不如血清中和試驗。

（1）材料準備：標準抗原通常用大瓶培養的犢牛睪丸或腎單層細胞制備，當細胞長成單層時，按每個細胞感染1個TCID50的Oregon C24毒株的復侵率進行接毒，之后于35℃培養4d，倒去維持液，加入標準的胰蛋白酶-EDTA細胞分散劑使細胞分散。離心沉淀，取沉淀病毒細胞，再用少量鹽水（約原培養液的1%）將細胞作成病毒懸液，冰凍保存備用。臨時用時，作成一定的稀釋度后與標準血清進行反應，檢驗其特異性，并標定其在本試驗中的最合適的確實效價。標準血清通常由實驗感染的康復豬采取，選取其中含有高價抗體者應用。這種血清經嚴格的特異性檢查，并于不同稀釋度下與標準抗原進行反應，確定本試驗合適的稀釋度。瓊脂板用pH7.4 0.01M PBS制備1%的瓊脂板。

（2）操作程序：先在平皿內瓊脂板上打孔，孔徑6mm，孔間距2mm，將周圍孔中最靠近平邊緣的一孔標記為1，并按順時針方向將其他各孔標記成2～6。標準抗原滴入中央孔，標準血清滴入1、3、5孔，將被檢血清分別滴入2、4、6孔。加完樣后將瓊脂板置濕盒內于室溫下感作24h判定。陰性反應及可疑反應孔應延長至28h，再作一次終判。

（3）結果判定：在正常情況下，標準陽性血清與標準抗原之間出現明顯的沉淀線，而標準陰性血清與標準抗原間不出現沉淀線。被檢血清與標準抗原間出現沉淀線時結果為陽性。而被檢血清與標準抗原間不出現沉淀線時結果為陰性。

[1] 牛國輝，季新成，段曉東，等.牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定[J].新疆農業科學，2010，（47）：986-991.