HPLC、HPLC-MS在經方成分分析及Co-IP、激光共聚焦在經方藥理機制研究中的應用

吳 瑩 陳向陽 玄子男 李宇航

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

經方指《傷寒論》和《金匱要略》所記載之方劑。經方具有用藥精當、劑量準確;組方嚴謹、配伍巧妙;劑型豐富、煎服有法;加減靈活、功效卓著等特點，為歷代醫家進行方劑研究的首選對象［1］。然而，經方的現代研究同樣面臨藥理作用機制復雜、有效成分不明確等問題，從而制約了經方在現代醫學領域的推廣以及國際化的進程。因此，憑借現代藥學、免疫學及分子生物學等技術手段，從經方主要活性成分的鑒定、藥理作用的分子機制等方面揭示經方的作用機制，是經方現代研究的重要關節之一。基于此，我們在本文將介紹高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)相關技術在經方成分鑒定，以及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、激光共聚焦技術在經方藥理作用機制研究方面的應用及思路。

1 HPLC及高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)技術在經方現代研究中的應用

現代藥理學研究需要明確藥物成分、含量以及質控。HPLC及其相關技術是以液體作為流動相，采用高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測器發展而成的一種分離分析方法，由于具有準確快速等優勢，常用于檢測藥物的主要成分及含量，是藥物分析研究中關鍵的質控技術。HPLC憑借其高效、高速、可分離大多數液體樣品等優勢，已經廣泛應用于藥物的含量測定［2-3］、成分分析［4-5］、質量控制［6-7］等方面。同時，利用HPLC的高分離效能和質譜技術(MS)的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點，將HPLC與MS聯合使用，更加有利于準確分析藥物組分［8-9］。HPLC及HPLC-MS聯用技術的優越性，使其廣泛被應用到經方成分及含量的鑒定中。經方的HPLC、HPLC-MS分析涉及經方樣品的前處理、經方成分的定量分析、定性分析以及經方的藥物代謝研究等方面。

1.1 經方樣品的前處理 經方湯劑是我國應用最早、最廣泛的一種劑型，是將加工炮制或未經炮制的藥材納入飲用水(或其他專用水)中浸泡，再經煎煮去渣取汁制成的液體制劑［10］。煎煮法是我國中藥復方傳統的提取方法，也是現代經方研究過程中最常采用的提取方法。煎煮方法直接影響到藥物有效成分的溶出量，不同經方煎煮方式會有所不同，需高度重視。魏惠珍等［11］將大黃36 g，厚樸27 g，枳實27 g，芒硝13.5 g浸泡在8倍量水中30 min，加熱煮沸后，文火慢煎40 min，放冷，紗布濾過得大承氣湯，用于大承氣湯HPLC指紋圖譜的研究。胡俊輝［12］稱取干姜、黃芩、黃連、人參各75 g，加10倍量的水浸泡2 h后，煎煮1 h，濾過再煎煮兩次，合并濾液，濃縮定容至2000 mL作為水煎液;采用RP-HPLC測定干姜黃芩黃連人參水煎液的11種藥效成分。

隨著科技的發展與科研的需要，許多新技術、新方法如超聲提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、微波萃取法等被應用到中藥化學成分提取中，其中超聲提取法也常被用于經方有效成分的提取，尤其在經方丸劑樣品溶液制備方面，更顯其重要性。如郭琪等［13］精密稱取麻仁潤腸丸樣品0.5 g，加甲醇25 mL，稱重，超聲(100W，45kHz)30 min，再用甲醇補足重量，搖勻濾過即得麻仁潤腸丸供試品溶液。李冬梅等［14］采用超聲提取法得止嗽定喘丸溶液，又通過固相萃取技術凈化處理樣品，用于止嗽定喘丸中鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量的測定。

1.2 HPLC及HPLC-MS聯用技術在經方成分分析中的應用 經方藥物組成變化多樣，所含化學成分類型眾多，結構復雜，數目龐大。如何將現代化的成分分析手段與現有的提取技術相結合，對于經方有效成分的分離分析至關重要，而HPLC法及HPLCMS可以實現多種成分分離分析，展現出獨特的優勢。

1.2.1 經方定量分析 由于HPLC具有簡便、快速、大大提高檢測效率等特點，已在經方研究中占據著重要的地位。HPLC通過定量分析經方的多種化學成分，可確定經方有效成分的含量、分析經方配伍效應、實現經方用藥的多指標質量控制，為經方的臨床應用提供科學依據。HPLC定量分析結果的可靠性和準確度還可通過標準偏差、日內以及日間精密度來衡量。毛瑩等［15］利用 HPLC法，采用色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，3種不同的流動相，4種梯度洗脫方法分別對葛根芩連湯中葛根素、大豆苷、大豆苷元，黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿，甘草酸銨、甘草苷進行了含量測定。堯愛珉等［16］采用HPLC法對梔子大黃湯中的9種特征成分進行定量測定，并分析該經方配伍前后成分的變化。實驗建立了HPLC-UV測定該經方水煎液中梔子苷、柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷的含量測定方法，結果顯示梔子大黃湯全方配伍能夠增加梔子苷及三種黃酮苷的含量;該實驗又采用HPLC-DAD法對梔子大黃湯中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚進行含量測定，發現枳實-大黃配伍可以增加五種蒽醌化合物的含量。朱繼孝等［17］建立HPLC-DAD法對梔子柏皮湯中梔子苷、甘草苷、西紅花苷-I、鹽酸藥根堿、西紅花苷-Ⅱ、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和甘草酸8種有效成分含量的同時測定，為該復方的質量控制與評價提供依據。劉晶晶等［18］采用反相HPLC法對三黃瀉心湯中生物堿類、黃酮類、游離蒽醌類、結合蒽醌類等四大類成分共16個藥效組分進行了含量測定，為中藥藥效組分質量評價方法的建立提供了科學依據。

1.2.2 經方定性分析 經方化學成分復雜，其間往往存在著復雜的相互作用關系，這正是經方發揮療效的基礎。通過對經方復雜成分體系中主要成分的定性分析，對于進一步揭示藥效物質基礎有著重要的意義。HPLC法不僅在有效成分含量測定方面展現了較高分析能力，而且在化學成分定性分析中也占據重要的地位。HPLC法利用樣品和對照品比對的方法進行定性分析，方法簡單，但必須是已知物，而將HPLC與質譜聯用可以克服定性分析時對標準品的依賴，可作為化學成分分析簡便準確可靠的方法。采用HPLC-MS可以在線獲取樣品中各化合物的多級質譜，通過與標準物質的多級質譜圖進行比較，或分析對照已知化合物的多級質譜圖［19］，可迅速對經方化學成分進行快速分析鑒別。汪航等［20］采用串聯質譜技術，分析鑒定出梔子大黃湯中的20個化合物，包括黃酮類、蒽醌類以及環烯醚萜類等。Qin等［21］采用 HPLC-ESI-MS分析方法對百合知母湯中的主要成分進行了鑒定;在正、負離子模式下獲得化合物的分子量信息，通過比對文獻數據及對照品質譜裂解信息，鑒定出了38個化學成分，包括4個酚酸糖苷、3個黃酮和31個皂苷。

通過將經方有效成分提取液質譜圖與組成該方各單味藥提取液質譜圖相對比，可對各成分的藥材來源進行歸屬。Xu等［22］建立了HPLC-ESI/MS/MS分析了大承氣湯組分的分析方法，采用反相C18色譜柱，梯度洗脫，負離子掃描模式，共鑒定出30個化合物;通過與標準品比對，確定了14個化合物，包括2個單寧酸、3個蒽醌、2個番瀉苷、5個黃酮、2個木脂素;通過與大黃、枳實、厚樸等單味藥提取液的質譜對比，發現單寧酸、蒽醌和番瀉苷來源于大黃，黃酮來源于枳實，木脂素來源于厚樸。王海燕等［23］采用HPLC-MS聯用技術對不同制法四逆湯中的化學成分進行了定性鑒別，共定性出傳統水提液28個化學成分，其中14個化學成分來自黑附子，7個化學成分來自干姜，余下7個化學成分來自炙甘草;有效部位組合液中30個化學成分，其中14個化學成分來自黑附子，8個化學成分來自干姜，8個化學成分來自炙甘草。楊楠等［24］為確定芍藥散中鎮痛活性部位中2個新化合物的來源，采用HPLC-MS/MS技術，正離子掃描，檢測方式為一級質譜掃描，子離子掃描和多反應離子監測，對該經方的6個組分藥材分別進行檢測，并以2個新化合物為對照品，最終確定二者均來源于白術。

1.3 HPLC及HPLC-MS聯用技術在經方藥物代謝中的應用 經方是一個的復雜體系，其藥效作用并不簡單的依賴于復方中已知化學成分產生，也可能來源于代謝產物。藥物代謝就是研究藥物進入體內后，在體液、酶等的作用下發生生化反應的過程，其研究內容包括代謝物的分離、鑒定、代謝途徑的追蹤、體內體外代謝的比較以及痕量分析測定［25］。經方本身化學成分的復雜性以及經方藥物代謝成分的未知性，對于探明復方中發揮療效的成分具有一定的挑戰性，但是現代分析技術和儀器的發展為經方藥物代謝研究提供了有力武器。HPLC及HPLC-MS技術不僅可以定量分析中藥復方有效成分及代謝物在體內的含量變化，而且可以定性分析代謝成分。

隨著藥物代謝動力學研究的不斷深入，探明經方有效成分的血清藥物濃度與藥理作用之間的關系也逐漸成為必不可少的環節。HPLC可實現對不同時間點血液中有效成分的含量測定，進而獲得血藥濃度;再以血藥濃度為指標，采用藥動學軟件擬合血藥濃度-時間曲線，以此來反應中藥復方的藥動學規律。陳月鳳等［26］采用HPLC法建立了大鼠灌胃給予葛根芩連微丸后血漿中葛根素、黃芩苷和小檗堿的濃度變化并繪制出血藥濃度-時間曲線，為進一步開展葛根芩連方制劑有效成分的血藥濃度與藥理作用提供參考依據。高宇勤等［27］采用HPLC技術測定當歸四逆湯中肉桂酸和甘草酸在大鼠血清中的變化，并利用3P97軟件計算這2種化合物的藥代動力學參數，發現肉桂酸和甘草酸吸收都比較快，但前者代謝較快，在體內滯留時間短。該課題組又研究了當歸四逆湯中阿魏酸在大鼠血清中的含量變化;采用HPLC方法，通過外標法測定其血藥濃度，發現大鼠口服當歸四逆湯后，阿魏酸吸收較快，但是消除慢［28］。

HPLC-MS具有速度快、選擇性強、檢測限低以及高定性能力等優點，已然是經方藥物代謝研究的理想工具。徐衛東等［29］采用HPLC-MS/MS法，對大鼠灌胃給予四逆散后血清中有效成分進行定性鑒別;結果共鑒定出芍藥苷、柚皮素、甘草苷、橙皮苷、橙皮素、甘草酸、柴胡皂苷d等7個原型成分，同時還檢測出甘草次酸、柚皮素葡萄糖醛酸、橙皮素葡萄糖醛酸等代謝產物。

總之，運用現代分析技術開展經方藥物研究，對于經方藥效物質基礎的發現、揭示經方配伍效應、闡明經方的作用機制，指導臨床規范化應用具有重要的意義。HPLC法應用于經方化學成分的分離分析，既簡便又準確可靠，而且將HPLC的高分辨能力與質譜的強定性能力相結合，可以獲得更多的化合物含量和結構信息。HPLC-MS對難以辨別的痕量化合物依然擁有較高的定性定量分析能力，其在今后的經方研究中的地位必將大大提升。

2 免疫共沉淀及激光共聚焦技術在經方現代藥理學研究中的應用

在經方的藥理作用機制研究方面，常用的方法有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫法等可用于檢測可溶性蛋白的濃度、western blot用于半定量檢測蛋白、PCR及熒光定量PCR檢測DNA及mRNA水平、免疫組化檢測蛋白在組織或細胞中的分布。以上方法分別在基因及蛋白表達水平檢測經方對于信號通路關鍵分子及目的蛋白的影響以明確經方的作用機制。然而，經方的成分復雜，且基于中醫“整體觀”的理論基礎，其藥理作用機制有“多靶點”“整體調節”的特點。因此，其作用特點可能不僅局限于對某個、某幾個蛋白的影響，而體現在對蛋白與蛋白之間、蛋白與核酸之間作用的影響。基于此，越來越多的中醫藥研究者開始重視免疫共沉淀技術在經方藥理作用研究中的應用。同時，大量研究表明，經方的藥理作用可能表現在對關鍵分子的細胞內定位、轉移的影響，因此，激光共聚焦技術也被廣泛地應用于經方的藥理機制研究中。筆者將結合課題組的研究，介紹免疫共沉淀及激光共聚焦技術在經方現代藥理研究中的應用。

2.1 免疫共沉淀技術在經方藥理機制研究中的應用 免疫共沉淀技術是一門以抗原和抗體特異性結合為基礎發展起來的研究目的蛋白和與其結合的大分子物質相互作用的技術。該技術主要用于蛋白質鑒定，還可應用于RNA和DNA鑒定等。該技術主要研究的是自然狀態下的蛋白質間相互作用，作用對象為天然蛋白，前提需要已知目的蛋白。主要操作步驟分為細胞裂解，標簽蛋白與目的蛋白結合，形成蛋白質復合體，清洗，洗脫，分離蛋白。

目前常用蛋白檢測技術如Western blotting、免疫組化技術，主要針對某種特定蛋白，分析目標過于局限，脫離了整體環境，而免疫共沉淀則針對蛋白質復合物，側重于大分子物質與蛋白質之間的相互作用，不再局限于一個單獨的靶點，通過捕獲復合物分析蛋白質調控的過程。目前主要應用于腫瘤研究、酶與病毒研究、信號轉導通路研究和寄生蟲研究等［30-31］。根據大分子物質不同，分為:

1)蛋白質-蛋白質復合物，這是最常見的免疫共沉淀，分離復合物后，聯合WB實驗，對目標蛋白進行驗證，如利用免疫共沉淀技術驗證 SET與eEF1A1在人肝細胞內的相互作用，推斷SET蛋白可能在三氯乙烯致癌的作用機制中起著重要作用［32］。

2)DNA-蛋白質復合物，又稱為染色質免疫共沉淀，分離復合物得到的DNA序列分別通過PCR技術、測序分析和芯片技術等進行序列分析，如通過免疫共沉淀驗證細胞內HIF-1與Id-1啟動子的結合部位［33］。

3)RNA-蛋白質復合物，分離復合物后RNA序列驗證方法同DNA類似，如免疫共沉淀與基因芯片技術聯合建立一種RNA 5’端帽子結構的鑒定方法［34］。另一方面，免疫共沉淀技術不僅可以驗證某種復合物的存在，還可以發現新的結合物質或作用方式，如運用免疫沉淀聯合質譜篩選肝核因子HNF3β相互作用蛋白質，尋找生理水平下新的蛋白復合體［35］。

中藥藥理學主要研究中藥作用于機體的機制和機體對于藥物的代謝。目前中藥復方(包括經方)的作用機制成為中藥藥理學的研究熱點，而其在機體作用過程復雜，特點為多靶點、多成分、多途徑。如果僅僅運用WB和免疫組化技術，已滿足不了中藥藥理機制的研究，免疫共沉淀技術如今已逐步運用于中藥復方分子機制的研究，如研究調心方對動物阿爾茨海默病相關tau蛋白磷酸化的調節及其可能的作用機制，利用免疫共沉淀驗證早老蛋白-1與其靶點tau蛋白的結合，確定兩種蛋白的確相互作用［36］。同時，免疫共沉淀與芯片技術聯合，作為一種高通量研究技術，恰恰為經方復方分子機制研究提供了可行的方法。

當然，免疫共沉淀技術仍有其局限性，一方面檢測的是蛋白質粗體物，驗證兩種蛋白質之間的相互作用不能確定為直接作用，另一方面，實驗具有一定的冒險性，用于免疫共沉淀的抗體選擇要慎重，以免出現假陽性，或無反應。

2.2 激光共聚焦技術在經方藥理機制研究中的應用 激光共聚焦技術是利用激光束透過照明針孔形成點光源對標本焦平面上的每一點進行掃描，被照射點在探測針孔出成像，通過光電倍增管或冷電耦器件接收，迅速在電腦屏幕上成像。由于照明針孔和探測針孔對于被照射點是共軛的，焦平面上的點可以同時在照明針孔和探測針孔處成像，焦平面以外的點不會成像。該技術克服了普通光學顯微鏡檢測時被檢測點收到附近相鄰點的干擾的缺點，可以形成清楚地光學橫斷面，圖像準確清晰，能進行實時監測，同時結合Z軸掃描還能做出三維成像。

激光共聚焦常常用于蛋白質檢測，為了提高分辨率和獲得高對比度圖像，一般需先使用帶有特殊熒光標記的抗體孵育染色，再沖洗后進行激光共聚焦檢測。如有需要，可以進行活體染色，還可同時直接進行兩色，甚至三色染色，當然，多色染色時需注意選取熒光波長差別較大的染料。筆者的課題中，曾對細胞中F-actin、細胞膜和ERM蛋白同時進行染色，從而分析經方對病毒感染的細胞中F-actin與ERM蛋白在細胞中分布的影響［37］。而免疫組化法無法觀察正常生理狀態下的組織形態，且進行復染時常常會引起顏色覆蓋，或顏色交叉后變色等問題。另一方面，共聚焦技術不僅可以對蛋白質進行定位監測，如分析目標蛋白在細胞或組織中的分布，通過檢測角蛋白和波形蛋白的表達可以進行滋養細胞的鑒定［38］，還可借助圖片分析軟件選取顯色部位面積求和，或統計熒光強度，進行定量檢測，同時兼顧了免疫組化與WB實驗的優點;不僅可以應用于體內試驗，對組織進行染色，還可應用于體外實驗進行細胞染色。激光共聚焦技術不僅可以檢測蛋白質，還可實時測定細胞內游離Ca2+、pH值及其他細胞內離子［39］。張麗萍等研究加味溫膽湯對抑郁型大鼠海馬神經細胞內鈣離子濃度的影響，采用激光共聚焦技術檢測Ca2+濃度變化情況，發現加味溫膽湯可能通過抑制海馬神經細胞鈣離子大量內流，發揮其抗抑郁效應［40］。

激光共聚焦目前已應用于中藥組織化學研究，如對白芷根中香豆素類成分的定位和定量研究［41］，還應用于中藥藥效學和藥理學研究，如用于中藥與天然藥物誘導腫瘤細胞凋亡的研究，觀察細胞核變化與凋亡小體、觀察線粒體膜電位變化、觀測活性氧自由基含量等，或對抗菌中藥成分進行機制研究［42］。其應用前景并不僅僅局限于上述方向，利用其實時監測功能，可以將其運用于藥物代謝動力學，或者用于分析藥物結構與功能的關系。

3 討論

綜上所述，免疫共沉淀技術可用于研究經方對蛋白之間相互作用的影響，激光共聚焦技術可觀察經方不同蛋白、離子的分布、轉位及含量的影響，結合常規核酸、蛋白定量技術以及免疫共沉淀、激光共聚焦可較為全面地分析經方對細胞內信號途徑的影響，從而分析經方藥理作用的分子機制;HPLC及HPLC-MS是目前最常用的藥理成分分析及質量控制的技術，同樣適用于經方成分的鑒定及分析，在經方藥理機制研究基礎上結合經方主要活性成分的分析，可使經方的臨床應用得到國內外同行的認可，有利于經方的推廣和應用。

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