動物模型在經方研究中的應用

高譽珊 劉 妙 張淑靜 鄭豐杰 許 紅 王 謙 吳 瑩 李宇航

(北京中醫藥大學，北京，100029)

中醫動物模型的建立與研究是連接中醫基礎研究和臨床應用的橋梁與紐帶，是深化中醫基礎認識的方法，同時也是中藥藥物作用機制深入研究的手段。動物模型是運用病因病機理論和臟象學說，把人類疾病的某些特征在動物身上加以模擬復制而成，是中醫學人體證候的具體再現。經過50多年的努力，中醫證候的動物模型研究通過不斷的發展和完善日漸成熟，已從簡單的證候模擬發展到更加注重體現中醫病因病機實質的造模手段。研究思路和造模手段有3類:一類是采用物理、化學、自然衰老、基因改變等方法，模擬中醫認識的致病因素，如外傷、寒凝、肝郁、氣虛等，制成的相應動物模型，此類屬病因模型;二類是多采用手術方法，模擬西醫病理機制，如血管阻塞、內皮損傷、微循環障礙和腸梗阻等，制成的相應動物模型，此類屬病理或病理生理模型;三類是采用物理、化學、手術等方法，模擬中醫臨床表現，此類屬癥狀類模型。

我團隊將動物模型應用到中醫基礎研究中，且獲得了一些經驗。本實驗室用于經方現代研究的動物模型10余種，例如:大鼠COPD模型、小鼠哮喘模型、便秘模型、胃炎模型、胃電節律失常模型、腦出血模型、寒熱證模型、帕金森氏病模型、癲癇模型等。現例舉五種，從造模方法、體會及經方研究等方面介紹如下。

1 慢性阻塞性肺疾病模型

1.1 造模方法 慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發展，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關。其病理學改變存在于中央氣道、外周氣道、肺實質和肺的血管系統。肺組織、氣管、支氣管上皮炎癥細胞浸潤，典型的肺實質破壞表現為小葉中央型肺氣腫，涉及呼吸性細支氣管的擴張和破壞［1］。

目前常用的COPD動物模型制作方法有采用熏香煙加氣管注內毒素和單純熏煙法復制大鼠COPD模型［2］。單純熏香煙法是每天單純熏5%香煙0.5 h/d，共3個月;熏香煙加氣管注內毒素法是在熏煙的基礎上分別于第1天、第14天經氣管注入內毒素。兩種方法的病理結果與臨床COPD患者病理結果相符，但癥狀稍輕。我們在過往的研究中，多數采用了熏煙加氣管注內毒素的方法，來進行臟腑表里相關理論的研究。

1.2 體會 這種方法看似簡單，但實際操作中有很多需要注意的方面。

1)環境影響:實驗需要選擇在SPF環境下進行，一是排除天氣變化等干擾原因，例如:春秋季節呼吸系統疾病高發，在注射完內毒素及熏煙后，動物精神及健康狀態較差，容易突發其他疾病，使研究結果受到影響;二是模型組動物熏煙后皮毛會附著煙霧顆粒，在換氣不良的環境下長時間共同飼養時會對未造模組產生影響，從而干擾試驗結果。

2)熏煙方法:熏煙過程中，要通過計算熏煙箱內的體積得出達到要求濃度所需的香煙數量，在注入香煙氣體后，實驗箱內氧氣含量有限，應嚴格控制箱內動物數量并且密切觀察，防止出現動物缺氧死亡的情況。

3)氣管內注射內毒素的方法有兩種:一種是經口腔向氣管內插入套管針，再注入內毒素。這種方法操作簡便，成功率高，對動物不會產生實質性損害，但對操作人員技術要求較高且無法控制藥液進入氣管以后的分布情況。另一種方法是切開皮膚，暴露氣管及支氣管，用注射器將等量內毒素分別注射入左肺和右肺。這種方法操作簡單，劑量控制準確，但傷口較大，護理不當易發生感染影響實驗結果。兩種方法各有千秋，但均可以達到利用內毒素對器官進行影響的目的。

4)麻醉藥物的選擇:在注射內毒素時需要將動物麻醉，此時不應選用能促進動物唾液分泌的藥物。

5)造模護理:注射內毒素時動物處于麻醉狀態，注射后等待其蘇醒的時間是最重要的環節，也是死亡高發的環節，護理人員一定要細心觀察并及時清理分泌的唾液和從氣管返出的藥物，保持呼吸道通暢，若是氣溫較低的季節還應注意動物的保暖，直至動物蘇醒。

1.3 經方研究舉例 本團隊曾采用大鼠COPD模型應用于經方大承氣湯衍化方宣白承氣湯的研究。通過用宣白承氣湯及加減方對COPD模型大鼠進行治療發現，宣白承氣湯可降低COPD大鼠模型的外周血和肺泡灌洗液中以上細胞因子含量，減輕全身及局部的炎癥反應［3］，改善COPD模型大鼠肺功能及血氣［4］，此外，基于此動物模型，我們還發現宣白承氣湯亦可降低MUC5ACmRNA水平及蛋白表達，增強AQP5 mRNA、AQP1、AQP3水平及蛋白表達，從而抑制氣道黏液高分泌［5-6］。

將COPD模型大鼠用于經方桔梗湯及其加味的研究。加味桔梗湯對COPD模型大鼠進行干預后發現，加味桔梗湯從肺治腸治療“肺病及腸”的效應機制可能與調節肺腸組織中NKA、VIP的含量有關［7］;同時發現，清熱解毒藥物配伍桔梗，在COPD的治療過程中能夠發揮增效(引經)作用，增加甘草具有協同增效(引經)作用［8］，此外，基于此動物模型，我們還發現桔梗引經入肺的作用機制可能與其增加病理狀態下肺組織中VIP含量、改變TFF3mRNA基因表達有關［9-10］。

COPD在中醫學中歸屬于咳嗽、上氣、喘證和肺脹的范疇。因此，基于本動物模型，還可用于多種可治療咳嗽、上氣、喘證和肺脹的經方的實驗研究，如小青龍湯、越婢加半夏湯、承氣湯等等。

2 卵清蛋白致敏支氣管哮喘小鼠模型

2.1 造模方法 支氣管哮喘，是一種以氣道高反應性可變的氣流阻塞為特征的氣道炎癥性疾病，其發病機制與氣道慢性炎癥變態反應氣道高反應以及氣道重構等相關。

目前常用的造模方法是采用OVA致敏激發法制備小鼠哮喘模型:即在第1天和第13天，腹腔注射OVA氫氧化鋁凝膠混懸液致敏，第15～21天，置于霧化箱中霧化吸入OVA激發。

2.2 體會 操作過程中同樣需要注意幾點:

1)環境影響:同COPD模型一樣，處理過的小鼠身上會沾染致敏煙霧，對不需要進行造模處理的組別會產生較大影響，需要進行一定距離的隔離處理并進行充足的換氣排風。

2)需要時刻觀察動物情況，防止缺氧致動物批量死亡的情況發生。

3)腹腔注射致敏藥物時務必選用氫氧化鋁凝膠制劑進行配置，氫氧化鋁粉末制劑不能達到良好的致敏效果。

4)不同組動物同時進行處理時要進行有效、全面的分隔，在激發過程中，動物情緒焦躁，會產生竄跑、跳躍的行為，若不進行全面的隔離會混淆組別。

2.3 經方研究舉例 本團隊曾采用哮喘模型小鼠用于經方大承氣湯的研究。通過用大承氣湯對支氣管哮喘小鼠進行干預，發現大承氣湯通過通腑降氣，調暢肺腸臟腑氣機，改善肺氣的宣發肅降，可在一定程度上改善小鼠模型肺部的癥狀及病理變化［11］，明顯減輕哮喘模型小鼠肺部炎癥，這一效應的發生可能與肺、腸神經肽NKA、TFF3及VIP的變化密切相關［12］。

哮喘，在中醫學中歸屬于哮證、喘證范疇。目前，對于哮喘的研究一直是呼吸系統疾病研究中的一個熱點，而中醫藥在治療哮喘方面也起到了重要作用。基于上述哮喘小鼠模型，還可用于多種可治療哮喘的經方的實驗研究，如射干麻黃湯、小青龍湯、桂枝加厚樸杏子湯、麻杏石甘湯等等。

3 大鼠直腸半結扎模型

3.1 造模方法 在臟腑表里相關理論的研究中，我們還常用大鼠直腸半結扎模型對動物進行一定干預，來研究對肺部的影響。大鼠直腸半結扎模型是指通過外部手段，造成大鼠直腸半狹窄，造成腸道不通的疾病動物模型。

常用操作方法為:無菌操作下打開腹腔暴露直腸，以10號線經腹壁在距肛門約1.5cm處從直腸下方繞過，將絲線兩端經腹壁引出至腹壁切口兩側，在引出的絲線內套入直徑為0.3cm的無菌鋼管后打結，退出鋼管，使直腸適度狹窄并懸吊于腹壁，關閉腹腔。

3.2 體會 大鼠直腸半結扎模型在造模過程中同時需要注意幾點:

1)麻藥的選擇:麻藥不能選擇對腹膜有刺激的藥物，例如水合氯醛。水合氯醛會對動物腹膜造成刺激，導致在實驗后期動物腸脹氣，肚大如鼓，有些傷口愈合不好的動物甚至會漲破。

2)無菌操作下暴露直腸難度較大，因為直腸位于腹后壁，暴露直腸勢必造成污染，因此，可以在不改變腹部臟器原有位置的情況下，靠手感將干凈的手指深入腹腔內將線從直腸后穿出，并輕輕將直腸稍稍拉出，最大限度減少手術對動物其他器官的影響。

3)術后護理:術后護理是所有動物手術造模后非常重要的一項，為了減少感染，在關閉腹腔時可滴入適當的抗生素;縫合時也要盡量針距適當，縫合平整，促進愈合;勤換干凈的墊料，給予充足的食物和水分防止相互撕咬。

4)拆線時，采用外科拆線法，用碘酒將暴露在外的縫合線消毒，將縫合線稍稍拉出腹腔后剪斷，從另一端拉出。

3.3 經方研究舉例 本團隊曾將直腸半結扎大鼠模型用于經方大承氣湯的研究。通過用大承氣湯對直腸半結扎模型大鼠進行干預，發現經大承氣湯干預后，大腸及肺臟病理改變減輕，肺泡灌洗液中淋巴細胞數量減少［13］，基于此動物模型，我們還發現，大承氣湯干預可明顯減輕直腸半結扎模型大鼠的肺部炎癥，這一效應的產生與肺組織中VIP、TFF3、NKA含量的變化密切相關［14］。

直腸半結扎動物模型的臨床癥狀變化類似于中醫便秘一證，主要引起腸道不通的疾病。基于此模型引起的癥狀改變，還可以將其用于承氣湯類方、麻子仁丸、蜜煎導、土瓜根、大豬膽汁等方的研究。

4 胃潰瘍大鼠模型

4.1 造模方法 胃潰瘍是一種臨床常見的具有反復發作傾向的消化系統疾病，臨床多以上腹部疼痛或不適，腹脹、反酸、惡心、嘔吐等為特征。相關研究眾多，因此制造改模型的手法也非常多，有應激性胃潰瘍模型、乙醇致大鼠胃潰瘍模型、幽門結扎型胃潰瘍模型、藥物誘發型胃潰瘍模型、和冰醋酸致慢性胃潰瘍模型，其中以冰醋酸致慢性胃潰瘍模型以其操作方法的簡便，易于復制，潰瘍面明顯且病理結構與人胃潰瘍極為相似而被廣泛使用。

本團隊使用經過改良的Okabe法進行實驗造模。具體方法為:將動物禁食48 h，麻醉后，固定于手術臺上，剃毛，消毒，鋪巾，于劍突下腹中線稍左分層切開腹壁，將胃引出，用內徑3 mm的玻璃管按在幽門無血管處，將蘸有純乙酸0.1 mL的細棉扦插入管內與胃黏膜接觸，留滯1.5 min后撤掉，擦凈殘留酸液，以大網膜包裹，送入腹腔，關腹。術后第3天，禁食12 h，用食管喂以5%NaHCO32 mL，15 min后用胃管注入幽門螺旋菌菌液1.5 mL(103cfu/mL)，30 min后喂食，3 d1 次，共3 次［15］。

4.2 體會 大鼠胃潰瘍模型在造模時需要注意以下幾點:

1)務必重視無菌操作，因為將胃部引出的過程中極易受到污染，使復原后的腹腔內形成大面積的粘連，影響潰瘍面的觀察及取材。

2)可在實驗前根據不同實驗室的情況及不同操作者的手法進行預實驗，找出適合本實驗組的實驗方法，若藥量過大或接觸時間過長會導致胃穿孔，若接觸不夠或藥量不夠則不能成功的造出潰瘍面。

3)選好手術通道，盡量選擇離操作區域較近的位置打開手術通道，使腹腔內容物位移盡量減小，一是復位簡單，減少手術造成的損傷，二是減少手術過程中的污染。

4)選擇手術通道時盡量避開血管，務必最大量減少出血，對防止腹腔內粘連有很大的作用，即使出血也在關腹前將血跡擦拭干凈。

5)除此種方法之外，也有操作者將乙酸打入漿膜下近肌層，禁食48 h后胃部基本排空，胃壁本十分薄，將藥物準確打入指定位置操作難度比較大。

4.3 經方研究舉例 本團隊曾將胃潰瘍大鼠模型應用于經方半夏瀉心湯的研究。通過半夏瀉心湯對胃潰瘍大鼠進行干預，發現半夏瀉心湯具有促進潰瘍愈合、降低愈合后潰瘍復發的治療作用。基于此動物模型，我們進一步對半夏瀉心湯進行拆方分析，發現本方甘補組藥物在促進潰瘍愈合、降低愈合后潰瘍復發方面起主要作用，而全方組則療效最佳［16］。本實驗的研究結果對指導臨床治療消化性潰瘍中醫用藥以及新藥開發等，都具有一定的參考價值。

胃潰瘍在中醫學中歸屬于“胃脘痛”“嘈雜”“泛酸”等病的范疇。因此，基于本動物模型，還可用于多種可治療“胃脘痛”“嘈雜”“泛酸”等癥的相關經方的實驗研究，如瀉心湯類方、小建中湯、理中湯、旋覆代赭湯、小陷胸湯等。

5 大鼠胃電節律失常模型

5.1 造模方法 胃電節律失常十分常見，它與胃功能性疾病密切相關，是發生胃運動功能障礙的一個重要原因。在實驗研究方面，多為動物體內注入各種激素制劑或藥物(如甲啡肽、亮啡肽、PGE2、腎上腺素)誘發胃電節律失常［17］，這種造模方法與臨床常見病因有差異，張氏［18］不規則飼喂大鼠胃電節律失常模型從病因角度講與臨床更為接近。

模型組以不規則喂養方法飼養4周，即動物逢單日正常進食、雙日禁食，以打亂正常的飲食節律，自由飲水，水中加人鹽酸(每升水加10 mol/L鹽酸10 mL)以破壞胃內酸堿環境，制備大鼠胃電節律失常模型，2周后胃竇部漿膜下埋置銀絲電極，7 d后記錄胃電慢波。

5.2 體會 大鼠胃電節律失常模型在造模時需要注意以下幾點:

1)在大鼠清醒狀態下檢測胃電波時，應盡量多人看管或將大鼠頭部固定，也可制作一些小配件防止大鼠回頭啃咬電極。

2)埋入電極手術時盡量避免使用對腹膜具有刺激的麻藥。

3)埋入電極時需要注意的是，一避免出血，二在關閉腹腔時盡量將出血擦干凈，能有效避免腹腔內器官粘連。

4)關閉腹腔前可加入適當抗生素防止感染。

5)埋入電極時注意無菌操作，防止胃部出現不必要的感染繼而引發糜爛。

5.3 經方研究舉例 本團隊曾將胃電節律失常大鼠模型應用于經方半夏瀉心湯的研究。通過觀察半夏瀉心湯及其拆方對胃電節律失常大鼠進行干預，發現半夏瀉心湯具有糾正胃電節律失常［19］、調節胃肌間神經叢c-kit陽性ICC含量的作用［20］，同時發現，半夏瀉心湯治療心下痞證(調節胃腸運動)的作用機制可能與其調節 SCF、c-kit基因表達有關［21-22］。

胃電節律失常與胃功能型疾病密切相關，是胃運動功能障礙的一個重要原因。雖然胃電節律失常大鼠模型不屬于中醫“證”的模型，但其臨床特征與心下痞的臨床表現相似，都以胃脘部滿悶不舒、惡心和(或)嘔吐、上腹飽脹感、食欲減退為特點。故此模型還可用于消化不良相關疾病的經方研究，如小陷胸湯、枳術丸、茯苓甘草湯、桂枝加芍藥湯、旋覆代赭湯、吳茱萸湯等等。

綜上所述，除了以上幾種常用的造模方法，我們還涉及很多動物模型的研究，被用于經方及其他中醫中藥的研究中，中醫動物模型的研究是一個長期的系統工程，需要隨著時代疾病譜的變化而不斷完善，將能夠反映人類疾病的動物模型，應用到經方研究中，揭示經方治療常見病、疑難病的現代生物學機制，為人類健康做出貢獻。

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