培養基制作應注意的幾個事項

古麗巴哈爾·斯迪克

(新疆庫爾勒市阿瓦提鄉畜牧獸醫站,新疆庫爾勒 841000)

培養基制作應注意的幾個事項

古麗巴哈爾·斯迪克

(新疆庫爾勒市阿瓦提鄉畜牧獸醫站,新疆庫爾勒 841000)

培養基是人工制備的一種液體或固體營養物質,是細菌培養和保存細胞的基礎。培養基應含有相應培養細菌所需的營養成分、PH、應無菌。培養基制造的基礎材料為水、肉浸汁(肉湯)、蛋白胨、瓊脂、明膠、酵母浸汁、鹽類和化學試劑等。然而培養基的質量對生物藥品的制造、分裝及檢驗有著至關重要的作用,因此,在制作培養基時應特別注意。

細菌;酶;培養基;酶促反應

培養基是細菌的人工養料，根據細菌的不同要求用人工方法將各種養料配制在一起成為維持和繁殖細菌的基礎，制備適用的培養基，提供細菌所需的營養物質和生長條件，了解其生長繁殖的規律，以提高生物制品質量和數量，提高對病原菌分離培養技術。故培養基的質量對生物藥品的制造，分裝及檢驗有著至關重要的作用。下面就是我在制作培養基生產過程中，對常遇到的一些關鍵性問題的認識與看法。

1 把好制作培養基原、輔料質量關

制作培養基的基礎就是肉肝胃酶消化湯（浸出液），因而牛肉、牛、羊、肝、胃等基礎原料要選擇新鮮、無異嗅、無病變、有彈性、浸出液透明清朗，能提供豐富的營養成分。制備肉浸汁，除選好的材料外，浸漬方法也很重要，浸泡目的是使肉組織的水溶性營養物質充分的溶解在水中。經做過的冷浸法和熱浸法煮肉湯的對比實驗表明，冷浸法的效果要比熱浸法好，現多采用冷浸法。由于菌種培養基要求比較高。因此配制時力求使用新鮮原材料，現配現用，以保證質量。不馬上使用的肉湯等要先流通1h后送冷庫保存備用。對于輔助材料，化學試劑等，都要先經廠化驗室檢驗合格后方可使用。

2 制備血斜培養基應注意的幾點

2.1 做好消毒準備工作

無菌間要徹底熏蒸消毒，采血器皿、分裝物品均要先高壓消毒，以防污染。無菌操作，嚴把質量關。

2.2 普通瓊脂在未加血前的制作是很關鍵的

首先pH值要適宜，一般控制在8.0左右即可。另外加瓊脂時也是有要求的。我們做過加粉狀瓊脂和條狀瓊脂的對比實驗，結果加粉狀瓊脂的培養基加血后不溶血，呈片狀，不能用。而加條狀瓊脂的加血后溶血，效果較好。因而制作鮮血瓊脂培養基時，都采用條狀瓊脂。

2.3 普通瓊脂加血前要徹底消毒

待溫度降至48～50℃時，加入采好的羊血，這樣既不至于溫度太高破壞血成分，也不至于溫度太低以至凝固，不能分裝。所以控制好溫度比較重要。

3 注意控制好培養基的最終pH

（1）細菌在培養基中分裂繁殖除溫度、空氣、營養條件外，對pH的反應也很敏感。酸堿度不適宜即便營養最豐富的培養基，細菌也不能很好地生長繁殖，或根本不發育。因而制備培養基必須正確測定pH。一般測定法有：①試紙測定法，此法簡單方便，但有誤差。②比色管測定法，現普遍采用此法。

（2）pH測定最重要的是防止反復加酸加堿，最好一次加妥。因為反復加酸加堿會增加培養基中氯化鈉含量，鹽含量太高會使滲透壓失去平衡而造成細菌的死亡，而且反復加酸加堿易使培養基發生渾濁和沉淀。為避此現象發生，采取加堿量計算的方法防止盲目加堿。可小試1000ml加堿量，從而推算全部加堿量。另外還應注意以下幾點：

①標準管必須準確，定期用電比校對。

②被測溶液和培養基的溫度不能太高或太低，因為指示劑在培養基內的反應與溫度有關。為真實反應培養基的pH值，測時溫度應在20～25℃左右近于體溫。

③比色管要顏色、厚薄、粗細必須一致。

④加指示劑的吸管和滴管應避免與培養基接觸，否則培養基進入指示劑內，造成指示劑反應顏色不準，影響結果。

⑤觀察時應在自然光下觀察，避免直對著太陽光和燈光。

4 控制好消毒溫度

培養基的消毒是否徹底是很關鍵的，消毒溫度和時間是保證培養基質量的重要一環，既要達到滅菌目的，又要保證各種營養成分不受或少受破壞。一般培養基消毒都是116℃，20～30min，而特殊培養基（如糖類培養基、石蕊牛奶培養基等）就有些特殊之處。溫度太高會導致糖分解產酸。以前曾多次發生過沖塞、變色等現象，后經幾次實踐，確定最佳消毒方案即110℃，20min，而且上下磅不能太快，以后很少再出現此類事情。

5 制作消化湯時應注意的事項

消化湯在培養基制作時應用非常普遍，無論是豬胃消化湯還是肉肝胃酶消化湯以及胰酶消化湯，其實質都是酶促反應。因此要想消化徹底，必須掌握影響酶促反應速度的因素。

5.1 溫度對酶促反應的影響

酶是蛋白質，消化溫度太高會使酶變性失活。酶的最適溫度是酶的反應速度達到最高峰的溫度，一般最適宜溫度為40～50℃，60℃以上即開始變性失活。經多次實踐，認為豬胃消化湯最適宜溫度為50～53℃，肉肝胃酶消化湯是56～58℃，消化液較清朗、徹底。

5.2 pH對酶促反應的影響

酶的活性受所在環境pH影響，溶液pH不同，酶的活性也不同。在其它條件不變時，酶在一定的pH范圍內活性最高，此pH為最適PpH，胃蛋白酶最適pH為1.5～2.5，我們一般控制在1.6～2.0，胰蛋白酶最適pH為7.8～8.4。因而無論搞豬胃消化湯還是肉肝胃酶消化湯都要加鹽酸，根據經驗，豬胃消化湯按1%加，肉肝胃酶消化湯按1.2～1.3%量加，測pH為1.8～2.0為宜。

5.3 底物濃度對酶促反應的影響

底物濃度與反應速度之間存在一定的函數關系。肉、肝、胃均為底物，因而要控制好底物與水的比例。一般配制豬胃液的比例是：豬胃：蒸餾水＝3：10，如果用于計數或選菌最好是3.5～10。肉肝胃酶消化湯比例為：新鮮牛肉2kg，新鮮豬肝0.5kg蒸餾水10000ml。

5.4 酶濃度對酶促反應的影響

當其他條件相同時，酶促反應速度與酶濃度成正比。肉肝胃酶消化湯中加胃蛋白酶0.4～0.5%。豬胃消化酶大多存在于腺體所分泌的消化液中，不需要另加，如胃質量差可適當加些胃蛋白酶促進消化。

5.5 消化時間

規程規定胃18～24h，視消化而定。一般我們消化22～24h便停止消化，視湯清朗為宜。抽取上清加熱煮沸，按2.5～3.0%量加入2N氫氧化鈉溶液調pH達3.8左右，停止消化，湯備用。

以上就是培養基在制作時的幾個問題，以及影響消化湯消化程度和速度的幾個因素。

[1] 王樹成.制作培養基過程中應注意的幾個問題[J].天津畜牧獸醫，1993，（1）：40.

[2] 孔怡，蔚承祥，鄭錚.如何提高制作母種培養基的質量[J].食用菌，2009，31（1）：27-28.