腫瘤患者自體外周血C I K/D C-C I K細胞培養制備技術及臨床應用研究進展

祝仲珍 ，王占科 ，傅穎媛

(1、南昌大學基礎醫學院免疫學教研室，江西 南昌330006；2、解放軍第九四醫院檢驗科，江西 南昌330002)

生物治療是除化學治療、放射治療和手術治療以外的新型腫瘤內科治療技術，自體免疫細胞治療技術作為腫瘤生物治療技術，被國家衛生計生委列入允許臨床應用的三類技術，其中腫瘤患者外周血細胞因子誘導的殺傷細胞 (Cytokine-induced Killer/Dendritic Cells and Cytokine-induced Killer cells，CIK/DC-CIK細胞)治療技術是廣泛應用于臨床的三類臨床醫療技術，其核心技術為腫瘤患者自體外周血CIK/DC-CIK細胞體外培養及其回輸技術。現將國內外腫瘤患者自體外周血CIK/DC-CIK細胞培養制備技術與生物治療研究進展，綜述如下。

1 自體外周血C I K/D C-C I K細胞

1.1 自體外周血CIK細胞概念 自體CIK細胞是指在體外由多種細胞因子誘導患者自體外周血單個核細胞 (peripheral blood mononuclearcell,PBMC)而生成的異質細胞群。惡性腫瘤患者的免疫機能存在不同程度的受損害，CD3+、CD8+、CD56+細胞數量降低，增殖后的CIK細胞具有T細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞非主要組織相容性復合物(MHC)限制性殺瘤的特點。與PBMC相比，CIK細胞中 CD3+、CD8+、CD56+細胞比例明顯升高，CIK 細胞對腫瘤細胞有很強的殺傷力，而且，CIK細胞越多，殺瘤效果越好。CIK細胞己成為過繼細胞免疫治療主要方法[1]。2009年，自體免疫細胞(T細胞、NK細胞)治療技術已經列入國家衛生與計劃生育委員會首批允許臨床應用的第三類醫療技術[2]，免疫細胞(T細胞、NK細胞)治療技術管理規范規定該技術適用于臨床上已完成安全性和有效性認證，并符合倫理要求，只涉及T細胞和NK細胞作為治療手段的醫療技術，這類技術包括自體CIK細胞、自體TIL細胞、自體DC/CIK細胞、自體CTL細胞、自體γδT細胞和自體NK細胞。這為腫瘤患者自體外周血CIK細胞培養技術與臨床治療研究成果轉化提供法律保證。

1.2 外周血DC-CIK細胞概念 自體外周血DCCIK細胞是自體DC細胞和CIK細胞共同培養后生成的異質細胞群[3]。DC和CIK共培養24h后，IL12的分泌量是CIK細胞單獨培養的6.93倍;可以高表達 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞， 低表達CD4+CD25+Treg細胞[4]，盡管DC細胞不具備直接殺傷腫瘤細胞作用，但DC細胞可刺激CIK細胞的增殖，分泌多種腫瘤殺傷細胞因子，比如TNFα和干擾素等[5]。自體外周血DC-CIK細胞抗腫瘤效果一般比CIK細胞好，但制備成本高。自身DC細胞與自身腫瘤抗原共刺激后，可增強抗腫瘤免疫應答，目前常用于腫瘤細胞疫苗的臨床預防[6，7]。

2 自體外周血C I K/D C-C I K細胞培養與性能和安全指標檢測

2.1 CIK/DC-CIK細胞體外誘導培養 CIK/DCCIK細胞體外誘導培養流程主要包括外周血單個核細胞分離，添加細胞因子(干擾素和IL-2)和淋巴細胞刺激分子(CD3單克隆抗體)體外誘導培養擴增等。CIK細胞培養技術是指通過貼壁等方法去除單核細胞(DC細胞)，只對淋巴細胞進行培養的技術；DC-CIK細胞培養技術是指外周血單核細胞(DC細胞)和CIK細胞分開培養，然后再共同培養的技術。DC-CIK細胞培養添加的細胞因子和CIK細胞培養添加的細胞因子有所不同，DC細胞的作用主要是腫瘤抗原提呈作用，為了增強DC-CIK細胞對不同腫瘤細胞殺傷的特異性，近年來，國內外學者提出腫瘤細胞抗原負載DC細胞培養，可增強DC-CIK細胞對特異腫瘤細胞的殺傷作用[8]。腫瘤細胞抗原負載DC細胞培養技術是指將腫瘤細胞抗原和DC細胞共同培養，共同培養后的DC細胞對腫瘤細胞識別能力增強，在患者體內對腫瘤抗原提呈給淋巴效應細胞的能力也增強，有文獻報道，DC-CIK細胞在體外對腫瘤細胞具有更好的殺傷效果，而單純的腫瘤抗原負載DC細胞可作為預防腫瘤的免疫細胞疫苗，在體內也可以發揮預防和抑制腫瘤細胞作用，DC-CIK細胞培養和制備，具有更好的臨床應用前景[9]。

有關外周血DC細胞培養、CIK細胞培養以及DC-CIK細胞培養方法，文獻報道很多[10，11]。DC細胞培養主要根據DC細胞的貼壁功能移去懸浮細胞，在貼壁細胞中加入GM-CSF、IL4誘導DC細胞。抗原負載DC細胞培養在DC細胞培養過程中，根據患者腫瘤的類型添加自制或商品化的腫瘤細胞抗原，一般添加 IL-1β、IL6、TNF-α 后，培養一段時間收獲抗原負載的DC細胞。CIK細胞培養在去除 DC 細胞后，添加 IFN-γ、IL2、抗-CD3、IL1培養收獲CIK細胞。DC-CIK細胞培養先培養DC細胞和CIK細胞，然后再共同培養。

多種細胞因子可用于CIK/DC-CIK體外誘導培養，在培養體系中添加的細胞因子種類對CIK/DC-CIK細胞培養效率和CIK細胞群種類具有重要影響，目前研究較多的細胞因子為IL12和IL15。IL12是一種免疫調節因子，可增強NK細胞和CD8+T細胞的細胞毒作用，誘導IFN-γ、TNF-α等分泌，也有文獻報道,IL12可和其它細胞因子如IL1β、IL2、IL4一起共同誘導CIK/DC-CIK細胞中的NK細胞活化和增殖，IL12能增強CIK/DC-CIK細胞毒活性，可能機制是降低Treg細胞的數量和抑制細胞凋亡，從而誘導CIK細胞的抗腫瘤活性增強[12-14]。雖然IL15單獨體外誘導不能顯著提高CIK細胞群中NK細胞的比例，但與DC細胞聯合培養，可大大提高DC-CIK細胞群中NK細胞比例，同時DC-CIK對靶細胞的殺傷作用也顯著增強[15]。

2.2 CIK/DC-CIK細胞CD分子檢測 CIK/DC-CIK細胞是以CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞為主的細胞群，隨著培養時間的延長，CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞的百分率均呈上升趨勢，而CD3+CD4+呈下降趨勢。臨床實驗室常見的檢測以CD3+CD8+和CD3+CD56+T細胞為主。

2.3 細胞毒活性測定 MTT法是常用方法。將培養后的DC-CIK細胞與腫瘤細胞株共培養，以DCCIK細胞為效應細胞，腫瘤細胞做為靶細胞，效靶比為5:1,10:1,20:1不等,37℃ 5%CO2培養24h，加入MTT試劑，繼續培養4h，吸去培養液，每孔加入150μl二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 490nm處測量各孔的吸光值。計算抑瘤率。由于MTT有致癌性，且要現配先用，現在已有CytoTox96非放射性細胞毒試劑盒可代替使用，操作簡便。

2.4 質量與安全指標檢測 加強感染控制工作是自體CIK/DC-CIK細胞制備和治療安全有效的前提和保證。自體外周血CIK細胞培養制備需要在國家技術監督部門批準并驗收的GMP(Good Manufacturing Practice)實驗室中完成。為保證治療質量，每次收集的細胞數應≥2×109個，活率應≥95%，CD3+CD56+細胞應占大多數，外源性因子(細菌、支原體、真菌、內毒素、病毒)檢測合格。

3 自體外周血C I K細胞臨床免疫治療機理

自體外周血CIK、DC-CIK細胞至少包括細胞毒T淋巴細胞、輔助性T淋巴細胞、NK細胞和DC細胞以及一些尚未完全清楚的其它免疫細胞，這些CIK免疫細胞均有直接和間接殺傷或抑制腫瘤細胞的作用。自體CIK/DC-CIK殺傷腫瘤細胞的功能，已經在體內外實驗得到證實。其殺傷機理基本明確[16-18]。CIK/DC-CIK的生物學活性主要是：(1)增殖速度加快，CIK細胞的主要效應細胞是CD3+CD56+細胞，在正常人外周血中只占1~5%，經過10~14d的誘導，CD3+CD56+細胞迅速增多；(2)CIK細胞是以CD3+CD56+T細胞為主的異質細胞群，較以NK細胞為主的LAK細胞具有更強大的殺瘤活性；(3)抵抗效應細胞凋亡；有研究表明CIK細胞在培養中表達FasL，能抵抗FasL+腫瘤細胞引發的效應細胞Fas-FasL凋亡，又可誘導Fas+腫瘤細胞凋亡[19]。

4 自體外周血C I K/D C-C I K細胞治療臨床應用

目前臨床上多采用化療聯合CIK/DC-CIK細胞治療的方式對腫瘤患者進行抗瘤治療，每次輸入的CIK/DC-CIK細胞不低于1×109個，4周為 1個療程，CIK/DC-CIK細胞治療與化療不應同時進行，一般間隔1~2周，為使治療安全有效，在使用CIK/DC-CIK細胞治療前應掌握禁忌癥，在患者治療后1、3、6個月和一年進行治療效果評估。

4.1 胃癌 胃癌患者化療后造成食欲下降和睡眠質量差，精神萎靡等癥狀。應用自體外周血CIK/DCCIK免疫細胞回輸治療聯合化療對進展期胃癌術后患者進行觀察，結果發現整體治療效果明顯優于單純化療組，其3年和5年生存率也明顯提高；胃癌相關腫瘤標記物CEA等含量明顯低于單純化療組。許多文獻報道，CIK治療胃癌患者治療效果還與CIK細胞的治療次數明顯正相關，提示外周血DC-CIK/CIK免疫細胞治療可作為胃癌治療的有效措施，聯合化療可明顯提高腫瘤患者的治療效果[20-22]。

4.2 肝癌 近年來許多學者研究觀察了患者自體外周血CIK/DC-CIK治療聯合肝動脈栓塞化療術(TACE)治療原發性肝癌患者(HCC)的效果并進行評價，在TACE間歇期間，用患者自體外周血CIK細胞進行回輸治療，發現觀察組生活質量(QOL)明顯得到改善，1年生存率、3年生存率等指標均顯著高于對照組，提示患者自體外周血CIK細胞免疫治療可以提高HCC患者的生活質量,延長生存期，可作為其它治療手段的有效輔助措施[23-25]。

4.3 乳腺癌 文獻報道患者自體CIK細胞免疫治療聯合化療治療晚期復發轉移性乳腺癌患者，效果明顯優于單純化療,可延長患者的生存時間，明顯降低患者厭食程度及疲倦乏力率,提高患者生活質量,對體質稍差的患者更加適合，可有效緩解化療的毒副作用[26-28]。

4.4 肺癌 肺癌患者手術比較困難，化療也容易出現耐藥問題，預后差。張菁超等研究了患者自體外周血CIK治療中晚期肺癌患者的效果，經CIK細胞治療的患者血免疫球蛋白、T細胞亞群均得到明顯好轉，肺癌患者的CD3+CD4+T細胞和CD4+CD8+的比例明顯高于治療對照組。CIK免疫細胞治療效率為42.9%,疾病控制率為83.3%，提示CIK免疫細胞治療可通過調節機體免疫系統,提高治療有效率,提高患者生活質量[29]。DC-CIK細胞聯合化療治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的臨床效果，DC-CIK聯合治療組患者的無進展生存期、總生存期及Karnofsky評分均高于單純化療組，提示DC-CIK細胞聯合化療可提高對非小細胞肺癌 (NSCLC)療效,改善NSCLC患者生存質量,降低化療的毒副反應[30-32]。

4.5 其它腫瘤 CIK或DC-CIK過繼免疫細胞可用于胰腺癌、腸癌、腎癌、白血病以及黑色素瘤等治療或聯合治療方面，安全性和有效性均有文獻報道[33，34]。CIK/DC-CIK細胞治療也存在嚴重的個體治療差異，治療有待進一步規范和管理，并進行多中心大樣本臨床療效研究，才可以得出明確的療效結論。

5 問題與展望

腫瘤免疫缺陷是導致腫瘤發生與發展的主要原因，無論手術、還是放療和化療都不是從改善患者免疫系統進行腫瘤治療的，而且化療無法徹底殺死靜止期腫瘤細胞，容易造成腫瘤的復發[35]。自體外周血CIK細胞治療技術治療有一定的優勢，主要表現在：(1)細胞免疫治療不僅直接發生抗腫瘤作用，更重要的是糾正了患者細胞免疫功能低下的問題，促進患者抗腫瘤免疫功能[36]；(2)治療可用于產生耐藥性腫瘤患者的治療；(3)對于失去手術機會或已復發轉移的晚期腫瘤患者，能迅速緩解其臨床癥狀，延長生存期[37]。自體外周血CIK細胞治療盡管具有安全有效等優勢，但當前仍存在一定的問題：一是回輸前質量控制標準國內外尚不統一，必須滿足一定的CIK細胞數和具有殺傷腫瘤細胞的免疫細胞百分比回輸到體內，才能達到一定的治療劑量；二是回輸次數尚沒有統一標準，而且受培養周期的約束；三是制備好的CIK細胞保存問題還存在困難，需要及時回輸；四是不同腫瘤患者、同一腫瘤患者不同階段的外周血CIK/DC-CIK在同樣的培養條件下培養效果不同，這對標準化CIK/DC-CIK培養以及制定統一的標準操作程序(SOP)文件帶來困難；五是在管理上CIK細胞制備、檢測和應用應屬于不同組織管理，互不隸屬，互相監督，保證自體CIK/DC-CIK細胞治療的安全性和可靠性。自體外周血CIK/DC-CIK細胞體外培養制備，回輸等諸多環節尚需要規范和管理，在自體CIK/DC-CIK細胞制備方面，細胞因子種類很多，需要添加多少種細胞因子以及多少劑量，研究不同患者外周血CIK最佳培養體系組成，都值得進一步研究和探討。

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