1-磷酸鞘氨醇對人臍靜脈血管內皮細胞增殖和遷移的影響及機制

苑永輝，戚勛，楊芳(遼寧省腫瘤醫院，沈陽0004;中國醫科大學附屬第一醫院;山東省地方病防治研究所)

1-磷酸鞘氨醇對人臍靜脈血管內皮細胞增殖和遷移的影響及機制

苑永輝1，戚勛2，楊芳3
(1遼寧省腫瘤醫院，沈陽110004;2中國醫科大學附屬第一醫院;3山東省地方病防治研究所)

摘要:目的觀察1-磷酸鞘氨醇(S1P)對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖和遷移的影響，探討其作用機制。方法將HUVEC分為A～F組，A組只加細胞培養液，B～F組分別加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L的S1P;采用CCK-8法檢測各組培養48 h的OD450值，Transwell實驗計數各組穿膜細胞數。將HUVEC分為3組，空白對照組加細胞培養液，低濃度組和高濃度組分別加10－7、10－6mol/L的S1P;采用Western blot法檢測ERK、p-ERK蛋白，計算二者比值。結果A～F組OD450值分別為0.50±0.03、0.51±0.06、0.65±0.04、0.82±0.19、0.99± 0.06、0.99±0.02，穿膜細胞數分別為(66.59±9.11)、(76.72±4.80)、(83.75±7.59)、(101.39±5.03)、(101.50 ±8.96)、(99.38±13.03)個/HP。D、E、F組與A組比較，P均＜0.05; B、C組與A組比較，P均＞0.05;d、E、F組間比較，P均＞0.05。空白對照組、低濃度組和高濃度組p-ERK蛋白與ERK蛋白比值分別為0.39±0.03、0.94± 0.07、0.97±0.05，低濃度組和高濃度組與空白對照組比較，P均＜0.01。結論S1P可通過MAPK/ERK通路促進HUVEC的增殖和遷移。

關鍵詞:1-磷酸鞘氨醇;內皮細胞;細胞增殖;細胞遷移;mAPK/ERK通路

Effect of sphingosine-1-phosphate onmigration and proliferation of HUVECs and itsmechanism

YUAN Yong-hui1，QI Xun，YANG Fang
(1 Liaoning Cancer Hospital＆Institute，Shenyang 110004，China)

Abstract:Objective To observe the effect of sphingosine-1-phosphate(S1P)onmigration and proliferation of human umbilicus vein endothelial cells(HUVECs)and to investigate itsmechanism.Methods HUVECs weredivided into，group A to group F，group A was only added with cell culturemedium，group B to group F were added withdifferentconcentrations of S1P(10－10，10－9，10－8，10－7and 10－6mol/L，respectively).CCK-8method was used todetect the OD450value 48 h after treatment，Transwell cellmigration assay was employed to investigate the number ofmigrated cells.HUVECs weredivided into three groups: the blank control group which was only added with cell culturemedium，low-dose group and high-dose group were added with 10－7and 10－6mol/L S1P; the protein expression levels of phospho-ERK and ERK weredetected by Western blotting，then the ratio of pERK to ERK was calculated.Results The OD450values of group A to group F were 0.50±0.03，0.51±0.06，0.65±0.04，0.82±0.19，0.99±0.06 and 0.99±0.02，and the numbers ofmigrated cells were(66.59±9.11)，(76.72±4.80)，(83.75±7.59)，(101.39±5.03)，(101.50± 8.96)and(99.38±13.03)/ HP.Significantdifference was found between group A and groupsd，E，F(allP＜0.05); nodifference was found between group A and groups B，C(all P＞0.05)，and nodifference was found between groupsd，E and F(all P＞0.05).The ratios of pERK to ERK in the blank control group，low-dose and high-dose groups were 0.39±0.03，0.94±0.07 and 0.97±0.05，and significantdifference was found between the blank control group and low-dose group，high-dose group(all P＜0.01).ConclusionS1P can promote themigration and proliferation ofHUVECs throughmAPK/ERK signaling pathway.

Key words:sphingosine-1-phosphate; endothelial cells; cell proliferation; cellmigration;mAPK/ERK signaling pathway

治療性血管新生是下肢缺血性疾病、缺血性心臟病等局部缺血性疾病的重要治療方法［1，2］，是將外源性血管新生誘導因子轉入組織中，增強缺血區的側支毛細血管新生，從而加速側支循環的形成［3］。這一過程與血管內皮細胞(VEC)遷移和增殖密切相關［4］。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一種具有重要生物學活性的溶血磷脂，可作用于5種G蛋白偶聯S1P受體(S1P1、S1P2、S1P3、S1P4和S1P5)［5］。目前尚未見S1P對VEC增殖和遷移作用的相關報道。2015年3～6月，我們檢測了S1P對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖和遷移的影響，并探討MAPK/ERK在其中發揮的作用。現報告如下。

1　材料與方法

1.1主要試劑S1P購自Enzo Life Sciences公司，HUVEC細胞株購于凱基生物;牛血清白蛋白(BSA)、PBS及RPMI1640培養基均購自Sigma-Aldrich公司，胎牛血清、青—鏈霉素和胰蛋白酶購自于Life Technology公司，結晶紫購自于國藥試劑;細胞增殖—毒性檢測試劑盒購自Dojindo公司，Transwell小室購自于Millipore公司，ERK多克隆抗體及phoshpo-ERK單克隆抗體購自于Cell Signaling Technology公司。

1.2細胞培養將HUVEC解凍復蘇后加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基，置于37℃、5% CO2培養箱內培養，待細胞融合至80%～90%狀態進行實驗。1.3HUVEC增殖能力觀察采用CCK-8法。HUVEC細胞經PBS清洗、胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，按2×103/孔接種于96孔板。正常培養24 h后棄培養液，換含有0.5% BSA的培養液預處理24 h，以達到細胞同步化。將細胞分為A～F組6組，A組只加細胞培養液，B～F組分別加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L的S1P 100 μL/孔;每組設5個復孔，繼續常規培養48 h;每孔加入CCK-8溶液10 μL，細胞培養箱內孵育4 h后，使用酶標儀測450 nm處的OD值，OD450值越大表示細胞增殖能力越強。

1.4 HUVEC遷移能力觀察采用Transwell實驗。取對數生長期HUVEC細胞，用含0.5% BSA的RPMI1640培養基血清饑餓24 h;經PBS清洗、胰蛋白酶消化制成含0.25% BSA的RPMI1640細胞懸液(5×105/mL)，上室加細胞200 μL。將細胞分為A～F組6組，A組下室只加細胞培養液500 μL，B～F組分別加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L 的S1P 500 μL，置于37℃、5% CO2培養箱中培養4.5 h;取出Transwell小室，用棉簽拭去上室面的殘余細胞，甲醛固定，結晶紫染色;風干后于顯微鏡下觀察細胞，取上、下、左、右、中間5個視野計數穿膜細胞數。實驗重復4次，取平均值。

1.5 HUVEC中p-ERK及ERK蛋白表達檢測采用Western blot法。取對數生長期HUVEC，按3× 105/孔接種于6孔板，待90%融合后分為3組。空白對照組加細胞培養液2.5mL，低濃度組和高濃度組分別加10－7、10－6mol/L的S1P 2.5mL; 4 h后加入100 μL裂解液中冰上裂解5min，收集蛋白于離心管后超聲破碎，繼續4℃冰上裂解40min。4℃離心15min，取上清液;用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣本99℃高溫水浴變性。取50 μg蛋白樣品，用10%的SDS-PAGE分離蛋白，通過電泳將蛋白印跡轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉。加入ERK多克隆抗體及p-ERK單克隆抗體，4℃孵育過夜，BCIP/NBT顯色。計算p-ERK與ERK蛋白比值。

1.6統計學方法采用GraphPad Prism6.0統計軟件。數據以珋x±s表示，比較采用單向方差分析。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 S1P對HUVEC增殖能力的影響A～F組OD450值分別為0.50±0.03、0.51±0.06、0.65± 0.04、0.82±0.19、0.99±0.06、0.99±0.02。D、E、F組與A組比較，P均＜0.05; B、C組與A組比較，P均＞0.05;d、E、F組間比較，P均＞0.05。

2.2 S1P對HUVEC遷移能力的影響A～F組穿膜細胞數分別為(66.59±9.11)、(76.72±4.80)、(83.75±7.59)、(101.39±5.03)、(101.50± 8.96)、(99.38±13.03)個/HP。D、E、F組與A組比較，P均＜0.05; B、C組與A組比較，P均＞0.05;d、E、F組間比較，P均＞0.05。

2.3 S1P對HUVEC中p-ERK與ERK蛋白表達的影響空白對照組、低濃度組和高濃度組p-ERK蛋白與ERK蛋白比值分別為0.39±0.03、0.94± 0.07、0.97±0.05，低濃度組和高濃度組與空白對照組比較，P均＜0.01。

3　討論

在生理條件下，完整的單層VEC系統是血管壁發揮正常功能的必要條件。而在許多血管病變的病理過程中，包括動脈粥樣硬化和血管再狹窄等，由于血管損傷導致內皮功能的喪失和失去完整性。因此，促進和恢復VEC完整性的研究極為重要。血管新生是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發展

而形成新的血管，主要包括血管基底膜降解，VEC的激活、增殖、遷移，重建形成新的血管和血管網三大步驟，是一個涉及多種細胞和多種分子的復雜過程［6］。血管新生在生長或發育上扮演重要角色，例如傷口愈合、女性經期、胎兒生長發育。在血管新生過程中，首要步驟是VEC在趨化因子的作用下發生遷移、增殖［7，8］。要達到治療性血管新生的目的，血管新生誘導因子必須作用于微血管內皮細胞的特異性受體，引起微血管內皮細胞增殖、遷移，形成毛細血管樣管腔結構，然后經過血管的重構形成新的毛細血管網［9，10］。

S1P是一種具有重要生物學活性的溶血磷脂，主要來源于細胞膜鞘磷脂的分解代謝。有研究表明，S1P1受體和S1P3受體通過G蛋白偶聯受體Gi來上調Rac引起細胞的趨化作用，S1P2受體通過G蛋白偶聯受體G12/13來激活Rho，從而下調Rac，進而抑制細胞的趨化作用［11，12］。內皮細胞大量表達S1P1和S1P3受體，而平滑肌細胞大量表達S1P2 和S1P3受體。因此，內皮細胞主要是通過G蛋白偶聯受體Gi來上調Rac引起細胞的趨化作用［13］，G蛋白偶聯受體可以激活MAPK/ERK信號轉導途徑［14］。MAPK信號轉導通路存在于大多數細胞內，在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應(如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等)的過程中具有至關重要的作用。MAPK/ERK是參與血管新生的重要信號轉導通路［15］，但目前尚未見S1P對VEC增殖和遷移的作用及與MAPK/ERK信號轉導途徑相關機制的研究報道。本實驗Western blot檢測結果發現，與A組相比，D、E、F組p-ERK/ERK上調，提示S1P可能在ERK信號通路的激活過程中發揮作用，促進VEC血管生成，從而增加局部組織的血流灌注量，有效改善微循環功能障礙。

本研究顯示，S1P能通過上調p-ERK，促進VEC增殖和遷移，由此推測S1P在缺血性疾病血管新生的發生和發展中具有一定作用，有利于缺血部位側支循環的形成，為治療性血管新生奠定理論基礎。

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收稿日期:( 2015-07-24)

作者簡介:第一苑永輝(1978-)，男，主管檢驗技師，博士學位，博士后在讀。研究方向為感染癥制御學與分子生物學。E-mail: yyxhdh@126.com

基金項目:遼寧省博士科研啟動基金計劃資助項目(20141183);遼寧省教育廳一般項目(L2012282)。

文章編號:1002-266X(2015)34-0011-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R331

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.004