N-乙酰半胱氨酸預處理對心臟移植大鼠供心缺血再灌注損傷的影響及機制探討

韓燕，李占清，王帥，鄔鵬宇，崔翔宇，楊學慧，王耕銀，楊方，鄭素琴，伊雪( 華北理工大學基礎醫學院，河北唐山063000;華北理工大學附屬醫院)

N-乙酰半胱氨酸預處理對心臟移植大鼠供心缺血再灌注損傷的影響及機制探討

韓燕1，李占清2，王帥2，鄔鵬宇2，崔翔宇2，楊學慧2，王耕銀2，楊方1，鄭素琴1，伊雪1
( 1華北理工大學基礎醫學院，河北唐山063000;2華北理工大學附屬醫院)

摘要:目的觀察N-乙酰半胱氨酸( NAC)預處理對心臟移植大鼠供心缺血再灌注損傷( IRI)的影響，并探討其機制。方法60只健康雄性Lewis大鼠隨機分為對照組、NAC供體預處理組、NAC受體預處理組各20只，每組10只分別作為心臟移植供體和受體。對照組、供體預處理組于摘取供體心臟前30 min經供體大鼠下腔靜脈分別注射生理鹽水0.5 mL、NAC 300 mg/kg，受體大鼠不處理;受體預處理組移植前30 min經受體大鼠下腔靜脈注射NAC 300 mg/kg，供體大鼠不處理。三組均行同種異體異位心臟移植，移植后24 h摘取移植心臟。光鏡、電鏡下觀察心肌組織學及超微結構變化，用免疫組化SABC法檢測心肌組織中的Caspase-3蛋白。結果光鏡、電鏡下，NAC預處理組心肌損傷較對照組減輕; NAC受體預處理組Caspase-3蛋白表達量高于NAC供體預處理組和對照組( P均＜0.05)，NAC供體預處理組和對照組相比差異無統計學意義。結論NAC預處理可減輕心臟移植大鼠供心IRI程度，該作用與其抑制心肌細胞Caspase-3蛋白表達從而抑制細胞凋亡有關。

關鍵詞:N-乙酰半胱氨酸;心臟移植;缺血再灌注損傷;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

心肌細胞凋亡、壞死是心肌缺血再灌注損傷( IRI)的重要機制［1］。N-乙酰半胱氨酸( NAC)是細胞內還原型谷胱甘肽的前體，可通過提高氧化酶活性減少心肌細胞損傷［2～5］，增加移植成功率。但是，NAC是否通過抗凋亡途徑保護移植心臟，尚未見報道。2012年9月～2014年12月，我們觀察了N-乙酰半胱氨酸( NAC)預處理對心臟移植大鼠供心凋亡蛋白Caspase-3表達水平的影響。現報告如下。

1　材料與方法

1.1動物分組及干預60只Lewis雄性大鼠(近交系，體質量200～220 g，由德國海德堡大學動物室提供，常規飼養)隨機分為對照組、NAC供體預處理組、NAC受體預處理組各20只，每組10只分別作為心臟移植供體和受體。對照組、NAC供體預處理組供體大鼠摘取供心前30 min經下腔靜脈分別注射生理鹽水0.5 mL、NAC 300 mg/kg，受體大鼠不做任何處理; NAC受體預處理組受體大鼠于移植前30 min經下腔靜脈注射NAC 300 mg/kg，供體大鼠不予處理。三組按文獻［6］方法行同種異體異位心臟移植，移植后24 h摘取移植心臟。

1.2心肌組織學觀察取各組移植心上小塊左心室壁心肌組織置于4%甲醛溶液固定，常規脫色、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織學變化。

1.3心肌組織超微結構觀察于冰臺上取1 mm× 1 mm×1 mm小塊心肌組織，2.5%戊二醛固定，環氧樹脂浸透、包埋、超薄切片，透射電鏡觀察心肌超微結構。

1.4心肌組織Caspase-3表達測定采用免疫組化SABC法。取心肌組織石蠟切片，二甲苯浸泡，梯度乙醇水化，用PBS( pH 7.4)沖洗2次。放入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，煮沸熱修復抗原;經一抗、二抗處理，滴加試劑SABC;各步間均用PBS漂洗3次，DAB顯色、自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。光鏡下觀察，Caspase-3陽性表達為心肌細胞細胞質中出現棕黃色顆粒［7］。陽性細胞百分比:無陽性細胞為0分，陽性細胞百分比1%～10%為1分，10%～50%為2分，50%～80%為3分，80%～100%為4分。陽性細胞染色強度:無陽性反應為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。Caspase-3蛋白表達量用上述兩項評分之積表示。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1心肌組織學變化對照組移植心心肌間質水

腫，內膜下有大量炎細胞彌漫浸潤，間質小血管擴張、充血，血管壁增厚，周圍炎細胞灶狀浸潤明顯，心肌細胞萎縮、斷裂，心肌損壞嚴重。NAC供體預處理組移植心心肌間質炎細胞浸潤，心肌細胞腫脹較明顯，心肌損傷較對照組輕。NAC受體預處理組移植心心肌組織中心肌間質散在炎細胞浸潤，個別心肌細胞水腫，心內膜損傷較對照組和NAC供體預處理組輕。

2.2心肌超微結構變化對照組移植心心肌纖維排列紊亂，部分肌絲斷裂、溶解，肌漿網擴大，線粒體腫脹，線粒體膜不清晰，見空泡形成。NAC供體預處理組移植心心肌纖維排列規則，少數線粒體腫脹，線粒體膜基本完整，見少量空泡形成。NAC受體預處理組移植心心肌纖維排列整齊，肌節明暗帶清晰，線粒體排列整齊，線粒體膜完整。

2.3心肌組織Caspase-3蛋白表達NAC受體預處理組Caspase-3蛋白表達量( 2.10±0.29)高于NAC供體預處理組( 1.25±0.05)和對照組( 1.21± 0.07)，P均＜0.05; NAC供體預處理組和對照組比較，P＞0.05。

3　討論

細胞凋亡是生理和病理情況下通過基因調控和酶促反應進行的細胞程序性死亡，是機體為維持內環境平衡的一種自我調節機制。細胞凋亡由許多細胞凋亡相關基因控制，凋亡誘導因素通過一系列的信號轉導通路激活相關基因調控凋亡。Caspase家族是一類進化相對保守、在特異天冬氨酸之后切割靶蛋白的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種細胞凋亡途徑的共同下游效應部分［7～9］。活化后的Caspase-3可切斷天冬氨酸殘基后肽鍵，導致細胞凋亡蛋白酶級聯反應、DNA斷裂，是細胞凋亡的主要效應因子［10～12］。

NAC是含有活性巰基的化合物，具有較強的抗炎、抗氧化作用，能干擾自由基生成、清除已生成的自由基、調節細胞的代謝活性。近年來，NAC在減輕心、腎、肺等臟器IRI中的作用日益受到重視［13～16］。本研究發現，對照組和NAC供體預處理組大鼠心肌組織炎性細胞浸潤較NAC受體預處理組重，細胞壞死和凋亡較多，線粒體損傷較重; NAC受體預處理組Caspase-3蛋白表達量高于NAC供體預處理組和對照組，而NAC供體預處理組與對照組差異無統計學意義。因此，NAC預處理可減輕心臟移植大鼠供心IRI，該作用可能與其抑制Caspase-3蛋白表達從而抑制細胞凋亡有關。

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收稿日期:( 2015-02-10)

通信作者:伊雪

基金項目:河北省留學人員科技活動項目擇優資助項目( 20100511)。

文章編號:1002-266X( 2015)30-0028-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R654.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.010