高濃度葡萄糖體外對大鼠視網膜Müller細胞活性的影響及其機制探討

曲虹，厲泉(山東省千佛山醫院，濟南250014)

高濃度葡萄糖體外對大鼠視網膜Müller細胞活性的影響及其機制探討

曲虹，厲泉
(山東省千佛山醫院，濟南250014)

摘要:目的觀察高濃度葡萄糖對體外培養大鼠視網膜Müller細胞活性的影響，探討其作用機制。方法體外傳代培養大鼠視網膜Müller細胞，隨機分為N、G15、G25、G35組，分別給予DMEM培養基及含15、25、35 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養基培養5 d。采用MTT法檢測各組細胞光密度值( OD值，代表細胞活性)，采用細胞免疫化學染色、免疫熒光( FITC標記)染色及酶聯免疫吸附試驗檢測低氧誘導因子1α( HIF-1α)和促紅細胞生成素( EPO)蛋白。結果N、G15、G25、G35組細胞OD值分別為0.83±0.02、0.55±0.02、0.45±0.02、0.33±0.02，組間比較，P均＜0.01。N組未見HIF-1α、EPO陽性細胞，G15、G25、G35組可見黃染的HIF-1α陽性細胞及呈綠色熒光的EPO陽性細胞。N、G15、G25、G35組HIF-1α蛋白OD值分別為0.02±0.01、0.58±0.02、0.75±0.02、0.92±0.02，組間比較，P均＜0.01; EPO蛋白OD值分別為0.03±0.01、0.48±0.02、0.33±0.02、0.25±0.02，組間比較，P均＜0.01。結論高濃度葡萄糖可降低體外培養大鼠視網膜Müller細胞活性，促進細胞HIF-1α、EPO蛋白表達可能是其作用機制之一。

關鍵詞:糖尿病視網膜病變;視網膜Müller細胞;葡萄糖;低氧誘導因子1α;促紅細胞生成素

Effect of high glucose on cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and the mechanism

QU Hong，LI Quan
( Qianfoshan Hospital of Shandong Province，Jinan 250014，China)

Abstract:Objective To observe the effect of high glucose on the cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and to investigate the mechanism.Methods Rats'retinal Müller cells of serial subcultivation were divided into N，G15，G25，and G35groups which were cultured by DMEM medium or DMEM medium containing 15 mmol/L，25 mmol/L and 35 mmol/L glucose for five days，respectively.MTT assay was applied to detect the optical density ( OD value which represents the cell viability) in all groups.The expression of hypoxia-inducible factor-1α( HIF-1α) and erythropoietin ( EPO) was detected by immunochemistry，immunofluorescence and enzyme linked immunosorbent assay.Results The OD values of the N，G15，G25and G35groups were respectively 0.83±0.02，0.55±0.02，0.45±0.02 and 0.33±0.02，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).There were no positive cells of HIF-1α and EPO in the N group.Cells presented yellow positive expression of HIF-1α by immunochemistry and green fluorescence positive expression of EPO by immunofluorescence in the G15，G25and G35groups.The OD values of HIF-1α protein were respectively 0.02±0.01，0.58±0.02，0.75±0.02 and 0.92±0.02 in the N，G15，G25and G35groups，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).The OD values of EPO in the N，G15，G25and G35groups were respectively 0.03±0.01，0.48±0.02，0.33±0.02 and 0.25±0.02，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).Conclusion High glucose may decrease the cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and increase the expression of HIF-1α and EPO which may be one of its mechanisms.

Key words:diabetic retinopathy; retinal Müller cells; glucose; hypoxia inducible factor-1α; erythropoietin

糖尿病視網膜病變是糖尿病嚴重的眼部并發癥，高濃度葡萄糖引起的視網膜微血管改變和神經細胞凋亡是其主要發生機制。Müller細胞是視網膜中重要的神經膠質細胞，對維持視網膜完整和正常功能等具有重要作用［1］。但是，高濃度葡萄糖對視網膜Müller細胞的影響及其與糖尿病視網膜病變發生的關系，目前尚不清楚。2011年12月～2014 年12月，本研究觀察高濃度葡萄糖對體外培養大鼠視網膜Müller細胞活性的影響，探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料出生5～7 d的標準實驗用清潔級Wistar乳鼠40只，雌雄不限，由青島市動物實驗中心提供。胎牛血清、DMEM培養液、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(美國Gibco公司)，D-葡萄糖、促紅細胞生成素( EPO) (美國Sigma公司)，抗鼠低氧誘導因子1α( HIF-1α)、EPO單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，WIP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京博奧森生物技術公司)，PV6001免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒和FITC標記二抗(北京中山生物技術公司)。

1.2視網膜Müller細胞傳代培養及分組將Wistar乳鼠酒精浸泡處死，剝離視網膜，經胰蛋白酶、乙二胺四乙酸消化后，過篩網、離心、棄上清，加入含10%血清的DMEM培養液吹打重懸細胞，調整細胞密度為5×105個/mL，接種于多聚賴氨酸包被的25 cm2培養瓶內培養。培養24 h后第1次換液，之后每3 d換液1次，培養7～10 d時細胞融合達80%，以1∶2方式進行傳代。每天用倒置顯微鏡觀察培養細胞的生長過程及形態學變化，免疫細胞化學染色檢測谷氨酰胺合成酶( GS)表達，以鑒定視網膜Müller細胞，取第3代細胞作為實驗對象［2］。顯微鏡觀察到第3代細胞胞體大、扁平，胞核清晰、核仁明顯，胞質豐富，可見粗大突起，呈鑲嵌樣排列，細胞分界不清; GS陽性細胞達95%以上;滿足實驗要求。將上述培養細胞隨機分為N、G15、G25、G35組，分別給予DMEM培養基及含15、25、35 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養基培養。

1.3細胞活性檢測各組培養5 d后，接種于96孔培養板，調整細胞密度為2×104個/mL，常規設5個復孔，并設立空白調零孔。培養液沖洗后每孔加入100 μL MTT溶液( 0.5 mg/mL)，室溫下孵育4 h后，翻板棄去MTT溶液，每孔加200 μL二甲基亞砜，酶標儀570 nm波長處測各孔光密度值( OD 值)。OD值越高代表細胞活性越強。

1.4細胞HIF-1α、EPO檢測①各組以每孔2× 104個/mL的密度接種于孔內預置1 cm2蓋玻片的24孔板中，處理5 d后終止培養，吸出培養液，PBS沖洗、多聚甲醛固定，取出蓋玻片置于載玻片上，羊血清封閉10 min，甩去多余液體，不洗。采用免疫細胞化學方法檢測HIF-1α( 1∶100)，倒置顯微鏡下觀察和照相;采用細胞免疫熒光( FITC標記)染色檢測EPO( 1∶100)，熒光顯微鏡下觀察和照相。②采用酶聯免疫吸附試驗檢測HIF-1α、EPO蛋白。各組培養瓶內加入WIP細胞裂解液500 μL提取蛋白，調整各組蛋白質濃度為5 μg/mL;接種于96孔板，每組設6個復孔，并設立空白對照孔和陰性對照孔，酶標儀檢測495 nm波長處各孔OD值。

1.5統計學方法采用SPSS11.5統計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組樣本均數間比較采用單因素方差分析，組間多重均數的兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組細胞活性比較N、G15、G25、G35組細胞OD值分別為0.83±0.02、0.55±0.02、0.45± 0.02、0.33±0.02，組間比較，P均＜0.01。

2.2各組細胞HIF-1α、EPO蛋白表達比較①N組未見HIF-1α、EPO陽性細胞，G15、G25、G35組可見黃染的HIF-1α陽性細胞及呈綠色熒光的EPO陽性細胞。②N、G15、G25、G35組HIF-1α蛋白OD值分別為0.02±0.01、0.58±0.02、0.75±0.02、0.92± 0.02，組間比較，P均＜0.01; EPO蛋白OD值分別為0.03±0.01、0.48±0.02、0.33±0.02、0.25± 0.02，組間比較，P均＜0.01。

3　討論

糖尿病視網膜病變是糖尿病嚴重危害視力的眼部并發癥之一，其發病與糖尿病病程有一定關系，持續的高糖、缺氧、缺血是糖尿病視網膜病變發生、發展的刺激因素［3］。研究發現，高糖環境不僅引起微血管的改變，還可引起神經節細胞、光感受器細胞等視網膜神經元的損傷、變性、凋亡，最終導致視力的喪失［4］。Müller細胞是一種膠質細胞，構成視網膜內精細的神經膠質細胞網［5］。Müller細胞在視網膜正常的生理活動中發揮重要作用，如營養和支持視網膜神經細胞，參與“血-視網膜屏障”的形成，傳遞神經細胞信號［6］。此外，Müller細胞還參與多種視網膜病理過程，在缺血缺氧性視網膜病變的神經損傷及再生過程中發揮重要作用［7］。由于Müller細胞對維持視網膜正常結構功能、調節神經元活動具有重要作用，所以保持Müller細胞正常生理功能狀態對整個視網膜功能的維持具有重要意義［8］。本

研究選用15、25、35 mmol/L這3個高糖干預濃度，觀察不同濃度高糖對視網膜Müller細胞的影響。結果發現，G15、G25、G35組細胞活性明顯低于N組，提示這3個高糖濃度均會引起Müller細胞的損傷; G35組細胞活性低于G25組，G25組細胞活性低于G15組，提示Müller細胞高糖損傷程度與葡萄糖濃度呈正相關。

心、腦等重要組織存在一種內源性保護現象，細胞感受低氧刺激可改變有關基因的表達，以提高細胞對損傷的耐受力［9］。低氧可提高細胞HIF-1α及其下游基因的表達，這些基因可使細胞防御功能增強，保護細胞免受進一步的損傷，上述基因被稱為低氧相關基因，包括HIF-1以及HIF-1下游的EPO和血管內皮生長因子等靶基因［10］。本研究結果顯示，N組未見HIF-1α和EPO蛋白陽性表達，而G15、G25、G35組均可見HIF-1α和EPO蛋白陽性表達。酶聯免疫吸附試驗結果顯示，HIF-1α蛋白表達隨葡萄糖濃度升高而增加; EPO蛋白在15 mmol/L葡萄糖濃度時表達明顯增加，之后隨著葡萄糖濃度升高而下降。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成，其中HIF-1α起活性作用［11］。正常氧狀態下，細胞不斷合成HIF-1α蛋白，又迅速被酶降解系統降解，所以N組無法檢測到HIF-1α蛋白表達［12］。HIF-1 DNA結合活性和轉錄活性雖受到氧分壓嚴格調節，但是HIF-1可以被多種細胞外刺激活化，無論缺氧或非缺氧情況，氧自由基和非自由基氧活性物質均可參與HIF-1活性的調節［13］。氧化應激水平的增高與糖尿病視網膜病變的發生、發展有關，這可能與高糖狀態下糖代謝、脂代謝紊亂導致自由基生成增加，而清除系統明顯受損有關［14］。HIF-1α是雙重作用因子，在一定條件下可產生抗凋亡等保護作用，但是超過一定的量，就會發揮促凋亡和促新生血管的作用［15］。本研究中15 mmol/L葡萄糖作用于細胞時，刺激Müller細胞啟動內源性自我保護機制，HIF-1α表達增加并誘導下游基因EPO表達增加;但當葡萄糖濃度過高時，細胞損傷進一步加重，細胞功能下降，盡管HIF-1α表達繼續增加，但EPO蛋白表達下降，此時HIF-1α可能發揮促凋亡和促新生血管生成的作用。

總之，高濃度葡萄糖可導致體外培養大鼠視網膜Müller細胞損傷，誘導細胞HIF-1α、EPO蛋白表達增加可能是其損傷機制之一，但其具體作用機制還需要進一步研究。

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收稿日期:( 2015-04-20)

通信作者簡介:厲泉( 1973-)，男，副主任醫師，主要研究方向為心血管疾病。E-mail: liquann@163.com

作者簡介:第一曲虹( 1973-)，女，副主任醫師，主要研究方向為玻璃體視網膜病變。E-mail: qh1009@126.com

基金項目:山東省自然科學基金資助項目( ZR2011HL057; ZR2013HM028)。

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0015-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R587.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.005