檢測癲癇大鼠腦組織中Glu、Gly、GABA含量的異硫氰酸苯酯柱前衍生HPLC技術的建立

李敏，潘群皖，王海華，王烈成( 皖南醫學院，安徽蕪湖400;安徽醫科大學)

檢測癲癇大鼠腦組織中Glu、Gly、GABA含量的異硫氰酸苯酯柱前衍生HPLC技術的建立

李敏1，潘群皖1，王海華1，王烈成2
( 1皖南醫學院，安徽蕪湖241002;2安徽醫科大學)

摘要:目的建立檢測癲癇大鼠腦組織谷氨酸( Glu)、γ-氨基丁酸( GABA)、甘氨酸( Gly)含量的異硫氰酸苯酯( PITC)柱前衍生高效液相色譜( HPLC)技術，并驗證其檢測效果。方法將海人藻酸( KA)或等量生理鹽水注射入大鼠海馬CA3區建立癲癇模型或對照，2周后分別取其海馬和皮層組織，采用PITC柱前衍生法處理樣品，采用醋酸鈉緩沖液和乙腈梯度洗脫，Venusil-AA氨基酸分析柱結合紫外檢測器檢測，計算Glu、GABA、Gly含量。結果在30 min內3種氨基酸完全出峰。在0.20～12.50 mg/L范圍內Glu線性關系良好，相關系數為0.999 3，日內精密度為1.46%，日間精密度為1.84%，加樣回收率為97.12%±2.98%;在0.01～6.25 mg/L范圍內Gly線性關系良好，相關系數為0.998 4，日內精密度為1.17%，日間精密度為1.62%，加樣回收率為96.63%±1.28%;在0.10～6.25 mg/L范圍內GABA線性關系良好，相關系數為0.999 4，日內精密度為1.00%，日間精密度為1.53%，加樣回收率為99.25%±2.98%。模型組海馬和皮層中Glu含量均高于對照組相應組織( P均＜0.05)。結論成功建立了檢測癲癇大鼠腦組織Glu、Gly、GABA含量的PITC柱前衍生HPLC技術檢測效果較好。

關鍵詞:癲癇;高效液相色譜;異硫氰酸苯酯;柱前衍生;谷氨酸;甘氨酸;γ-氨基丁酸;大鼠

Establishment of HPLC technology of precolumn derivatization with PITC in determining contents of Glu，Gly and GABA in brain tissues of rats with epilepsy

LI Min1，PAN Qun-wan，WANG Hai-hua，WANG Lie-cheng
( 1 Wannan Medical College，Wuhu 241002，China)

Abstract:Objective To establish high-performance liquid chromatography ( HPLC) technology of precolumn derivatization with phenyl isothiocyanate ( PITC) to determine the contents of glutamic acid ( Glu)，glycine ( Gly) and γ-aminobutyric acid ( GABA) in the brain tissues of rats with epilepsy，and to verify the results.Methods Kainic acid ( KA) was injected into the hippocampus CA3 region of rats to make the epilepsy models.Two weeks later，we obtained the hippocampus and cortex tissues，respectively.The diluted samples were precolumn derivatizated with PITC.The mobile phase consisted of sodium acetate and acetonitrile gradient elution.We calculated the contents of Glu，Gly and GABA in hippocampus and cortex by venusil-AA column combined with UV detector.Results The amino acids were separated within 30 min.A good linearity was obtained from ( 0.20-12.50) mg/L of Glu，the correlation coefficient was 0.999 3，the intraday RSD was 1.46%，interday RSD was 1.84%，and the average recovery rate was 97.12%±2.98%.A good linearity was obtained from ( 0.01-6.25) mg/L of Gly，the correlation coefficient was 0.998 4，the intraday RSD was 1.17%，interday RSD was 1.62%，and the average recovery rate was 96.63%±1.28%.A good linearity was obtained from ( 0.10-6.25) mg/L of GABA，the correlation coefficient was 0.999 4，the intraday RSD was 1.00%，interday RSD was 1.53%，and the average recovery rate was 99.25%±2.98%.Conclusion The HPLC technology of precolumn derivatization with PITC in determining the contents of Glu，Gly and GABA in the brain tissues of rats with epilepsy is successfully established.

Key words:epilepsy; high-performance liquid chromatography; phenyl isothiocyanate; precolumn derivatization; glutamic acid; glycine;γ-aminobutyric acid; rats

癲癇是臨床常見的一種難治性中樞神經系統疾病，中樞神經系統內興奮性氨基酸和抑制性氨基酸含量的變化，特別是兩者比例的失衡可能是導致癲癇反復發作的直接原因［1］。因此，快速精準地測定腦內氨基酸類遞質含量，對癲癇的臨床診斷和防治具有重要意義。目前，通常采用柱前衍生結合高效液相色譜( HPLC)技術進行氨基酸測定，鄰苯二甲醛( OPA)、丹磺酰氯( Dansyl-Cl)、氯甲酸芴甲酯( FMOC-Cl)、2，4-二硝基氟苯( DNFB)是常用的柱前衍生試劑［2～5］。OPA衍生反應迅速，靈敏度高，但其衍生產物極不穩定，且不與二級氨基酸反應; Dansyl-Cl雖衍生產物穩定，但需要在加熱條件下衍生，時間較長，生成1、2代衍生混合物會干擾分析; FMOC-Cl幾乎可以和所有氨基酸迅速反應，衍生產物穩定性高，但過量FMOC與其水解產物會干擾測定; DNFB屬劇毒易爆物質，有強致癌性，且極易損壞色譜柱。因此，建立一種安全、高效、高靈敏度的腦內氨基酸遞質檢測方法尤為重要。異硫氰酸苯酯( PITC)衍生產物單一穩定，紫外吸收強度大，檢測限可達10－9mol［6］。本研究擬建立檢測癲癇大鼠腦組織氨基酸含量的PITC柱前衍生HPLC技術，并驗證其檢測效果。

1　材料與方法

1.1材料雄性Wistar大鼠16只，220～260 g，清潔級，南京醫科大學實驗動物中心提供［SCXK(蘇) 2002-0031］。谷氨酸( Glu)、γ-氨基丁酸( GABA)、甘氨酸( Gly)、PITC均購自Sigma公司。Agilent 1100 HPLC儀(美國Agilent公司)，FSH-Ⅱ型電動勻漿器(江蘇金壇國勝實驗儀器廠)，TGL-18R高速冷凍離心機(珠海Hema醫學儀器有限公司)，FLexi-DryTM冷凍干燥機(美國FTS系統公司)，MODEL 828 pH計(美國ORION公司)，SK5200HP超聲波清洗器(上海歡奧科貿有限公司)。

1.2色譜條件及試劑配制色譜條件:①色譜柱: Venusil-AA氨基酸分析柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm) ;②流動相A為50 mmol/L乙酸鈉( pH 5.5，含5%甲醇)，流動相B為100%乙腈，進樣量為50 μL，流速為1 mL/min，柱溫為40℃，最大壓力為250 bar，紫外檢測波長為254 nm;③梯度洗脫程序:流動相A在0、20、30、40、40.01、50.00、50.01 min時分別為100%、90%、82%、70%、0%、0%、100%，流動相B分別為0、10%、18%、30%、100%、100%、0。試劑配制:①三乙胺乙腈溶液:三乙胺1.4 mL，乙腈8.6 mL，混勻，避光保存于4℃冰箱;②PITC乙腈溶液: PITC 25 μL，乙腈2 mL，混勻，充氮密封于－20℃冰箱;③氨基酸標準溶液配制:精密稱取Glu、 Gly、GABA粉末各10 mg，用2 mL 100 mmol/L HCl充分溶解，稀釋成濃度為5×10－2mg/mL儲備液，于－20℃冰箱保存備用。

1.3癲癇模型建立及腦組織樣品預處理大鼠經水合氯醛( 350 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于立體定位儀上，暴露顱骨，依據大鼠立體定位圖譜［7］確定右側海馬CA3中心區為注射靶點( AP:－4.0 mm，ML: 4.40 mm，DV:3.8 mm)。將2.5 μL海人藻酸( KA，0.4 μg/μL)注射入海馬CA3區，術后縫合頭皮，建立癲癇大鼠模型(模型組，n =8)［8，9］。另取8只大鼠采用同樣方法注射生理鹽水，作為對照組。2周后，將兩組迅速斷頭取腦，冰上快速分離海馬和皮層，稱質量;加入預冷的生理鹽水，冰上電動勻漿( 25 000 r/min 10 s) ;勻漿液經4℃離心( 12 000 r/min、20 min)，取上清; 加3倍體積乙腈，混勻，4℃離心( 12 000 r/min、10 min)，取上清;經冷凍干燥后，流動相A液充分溶解，4℃離心( 12 000 r/min、10 min)，取上清，流動相A液稀釋，保存于4℃冰箱。

1.4大鼠腦組織中Glu、Gly、GABA含量檢測采用PITC柱前衍生HPLC技術檢測腦組織中Glu、Gly、GABA含量。具體步驟:①衍生化反應:取混合氨基酸標準溶液或稀釋腦組織樣品200 μL，置于1 mL離心管中，加入三乙胺乙腈溶液100 μL，PITC乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1 h;加入正己烷400 μL，振搖后放置10 min，將上層正己烷去除;再加入400 μL正己烷，振搖后放置10 min，取下層溶液，經0.45 μm濾膜過濾后，收集在進樣管中，待測。②Glu、Gly、GABA標準曲線的建立:精確量取混合氨基酸標準溶液儲備液1 mL，采用倍比稀釋法配制以下濃度的標準溶液( mg/mL) : 2.50×10－2、1.25× 10－2、6.25×10－3、3.13×10－3、1.56×10－3、7.81× 10－4、3.90×10－4、1.95×10－4、9.77×10－5、4.88× 10－5、2.44×10－5、1.22×10－5、0.61×10－6。衍生化后，依據1.2色譜條件進樣分析，以峰面積對標準溶液濃度( X)進行線性回歸。③衍生產物穩定性測定:已知濃度的混合氨基酸標準溶液( 1.56×10－3mg/mL)衍生化后于第0、2、4、8、12、24、48、72小時進樣分析，計算Glu、Gly及GABA衍生產物峰面積的日內相對標準偏差和日間相對標準偏差。④精密度測定:已知濃度的混合氨基酸標準溶液( 1.56× 10－3mg/mL)衍生化后同日內平行進樣5次，測定Glu、Gly及GABA峰面積，同時計算其日內相對標準偏差;混合氨基酸標準溶液分5 d、5次衍生化后進樣，測定Glu、Gly及GABA峰面積，同時計算其日間相對標準偏差。⑤加樣回收率測定:各取1份預

處理后的已測定濃度的癲癇大鼠海馬和皮層樣品，分成3份，分別加入等體積0.78、1.56、3.13 μg/mL混合氨基酸標準溶液，衍生化后進樣分析，分別計算Glu、Gly及GABA加樣回收率。

1.5統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 PITC柱前衍生HPLC色譜檢測結果空白試劑色譜圖中可見除雜質峰外，無其他色譜峰;氨基酸混合標準溶液色譜圖中Glu的保留時間為16.58 min、Gly為19.52 min、GAGA為29.70 min;大鼠海馬組織樣品氨基酸分離色譜圖的雜質峰和試劑峰與Glu、Gly、GABA峰完全分離。見圖1。

圖1　PITC柱前衍生HPLC色譜檢測結果

2.2線性范圍和最低檢測限在0.20～12.50 mg/L范圍內，Glu標準溶液線性方程為Y = 1.5× 104X +2.7×103( r =0.999 3) ;在0.01～6.25 mg/L范圍內，Gly標準溶液線性方程為Y =1.0×105X + 1.6×103( r = 0.998 4) ;在0.10～6.25 mg/L范圍內，GABA標準溶液線性方程為Y = 1.1×105X－6.1×103( r =0.999 4)。在上述條件下，Glu的最低檢測濃度為0.012 mg/L，Gly為0.006 mg/L，GABA 為0.006 mg/L。

2.3衍生產物的穩定性測得同一混合標準溶液中Glu、Gly、GABA衍生產物色譜峰峰面積的日內相對標準偏差分別為2.64%、2.48%、1.52%，日間相對標準偏差分別為4.38%、5.03%、3.71%。

2.4精密度和加樣回收率同一混合標準溶液中Glu、Gly、GABA保留時間的相對標準偏差均＜1%，峰面積的相對標準偏差均＜2%。Glu加樣回收率為97.12%±2.98%，Gly為96.63%±1.28%，GABA為99.25%±2.98%。

2.5兩組大鼠海馬和皮層Glu、Gly、GABA含量模型組海馬和皮層中Glu含量均高于對照組相應組織( P均＜0.05)，Gly、GABA組間比較差異不明顯( P均＞0.05)。見表1。

3　討論

柱前衍生HPLC技術是檢測腦內氨基酸含量的常用方法。但是，氨基酸不具有紫外和熒光吸收基團，并且腦內含量很低;此外，腦組織中除了氨基酸類遞質外還存在許多其他復雜的成分。因此，若要實現癲癇患者或動物腦組織中氨基酸含量的快速精

表1　兩組大鼠海馬和皮層組織中Glu、Gly、GABA含量( mg/g，±s)

表1　兩組大鼠海馬和皮層組織中Glu、Gly、GABA含量( mg/g，±s)

注:與對照組同組織比較，*P＜0.05。

組別　n Glu　Gly　GABA模型組8海馬　1.19±0.35*　0.14±0.02　 0.07±0.01皮層　1.11±0.19*　0.13±0.01　 0.07±0.01對照組　8海馬　0.28±0.04　 0.09±0.02　 0.03±0.01皮層0.12±0.02　 0.07±0.01　 0.02±0.00

準檢測，同時保證其有足夠的分離度，選擇合適的色譜條件、優化的衍生反應、合理的樣品預處理是關鍵。

3.1色譜條件的選擇本實驗流動相A選用醋酸鈉緩沖液，考察不同濃度( 100、75、50、25 mmol/L)醋酸鈉緩沖液對氨基酸分離的影響。結果發現，隨著緩沖液濃度的增大，氨基酸分離度有所增大，但過高濃度會破壞色譜柱鍵合相的穩定性，降低柱效［10］。綜合考慮，選擇緩沖液濃度為50 mmol/L。PITC氨基酸衍生物分離通常采用pH 5.0～7.0醋酸鹽緩沖液。本實驗考察了不同pH條件( 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對氨基酸分離效果的影響，結果發現，pH為7.0時分離度較差;隨pH減小，保留時間延長，但分離度有所改善。綜合考慮，選擇pH為5.5。但單純采用醋酸鈉緩沖液3種氨基酸未能得到良好的分離，因此，本實驗在流動相A中加入有機溶劑甲醇( 5%)，對比使用甲醇前后的色譜圖，發現加入甲醇后氨基酸分離度明顯提高。在此基礎上對色譜分離的洗脫梯度進行分析，最終確定洗脫梯度。提高柱溫能縮短保留時間，但過高的柱溫會降低分離度，使GABA與其他色譜峰重合。因此，實

際操作時柱溫保持在40℃為最佳。在梯度洗脫過程中，100%乙腈沖洗10 min后，若色譜柱平衡時間較短，連續進樣則會影響保留時間，故每次進樣后設定色譜柱平衡30 min后再次進樣。

3.2衍生反應的優化衍生反應是決定氨基酸重現性和檢測效果的決定步驟。PITC作為衍生試劑在測定氨基酸含量時在室溫進行，具有穩定、不易發生水解反應、不形成多級衍生產物的優點［11］，但有時過量試劑會使色譜柱填料過早老化，連續使用會導致柱效顯著下降［12］。本實驗在衍生反應中重復兩次用正己烷萃取去除過量衍生試劑，同時，在柱前增加1根具有C18填料的保護柱，以延長色譜柱的使用壽命，為準確分析近500個樣品提供了可能性。

在衍生產物穩定性檢測過程中發現，PITC氨基酸衍生產物至少在24 h內保持較高的穩定性。其穩定性主要受溫度及pH影響，室溫下衍生產物在pH 5.0～7.5比較穩定，在pH 7.5時穩定性最高;過高的pH會使色譜柱受到損害;而酸性狀態下衍生產物極易分解［13］。本實驗事先采用鹽酸溶液處理標準品，然后在衍生體系中加入適量三乙胺乙腈溶液，利用三乙胺的堿性來保證衍生化反應的順利進行，同時維持衍生產物在一定時間內保持較高的穩定性，為精準測定提供了可能。

3.3樣品預處理的改良為避免活性下降，處理癲癇大鼠腦組織時應快速、準確，取樣、勻漿、離心都要在0～4℃進行，樣品－80℃冷凍保存。樣品預處理的好壞與分析結果的準確性與重現性關系很大，測定氨基酸含量時，為了將更多的氨基酸游離出來，蛋白質的去除很關鍵。去除蛋白的方法包括無機酸或有機溶劑沉降法，血漿、尿液標本常采用磺基水楊酸沉淀蛋白，組織標本則常用高氯酸、三氯乙酸和苦味酸;有機溶劑主要是70%～90%甲醇(或乙腈)［14］。本研究中腦組織樣品中蛋白的去除以100%乙腈效果最為理想。此外，為了防止溶液中微小顆粒阻塞色譜柱導致柱效下降，各種溶液在使用前都要進行純化處理。采用超純水，現配現用，并用0.22 μm濾膜過濾;每次檢測完成后要及時徹底沖洗整個系統。本研究欠妥之處在于，回收率測定時未選用內標進行樣本萃取回收實驗，而是利用外標法直接進樣定量測定，可能會存在一定誤差，在以后的實驗中進一步改進。

本實驗選擇了合適的流動相緩沖液及pH值，設定了合理的梯度洗脫程序，調整了衍生反應體系pH，優化了樣品預處理的過程，癲癇大鼠腦組織中Glu、Gly、GABA在上述分離條件下分離效果良好，其標準曲線相關系數分別為0.999 3、0.998 4及0.999 4，平均回收率均＞95%; Glu含量較對照組增加，Gly、GABA含量與對照組差異不顯著，與早期研究結果一致［9］。以上結果說明，本研究成功建立了檢測癲癇大鼠腦組織氨基酸含量的PITC柱前衍生HPLC技術。

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收稿日期:( 2015-03-29)

通信作者簡介:王烈成( 1969-)，男，教授，主要研究方向為神經電生理。E-mail: wangliecheng@ ahmu.edu.cn

作者簡介:第一李敏( 1985-)，女，助教，主要研究方向為神經電生理與藥理。E-mail: limin851022@163.com

基金項目:國家自然科學基金面上項目( 81071075) ;安徽省自然科學基金資助項目( 090413096) ;皖南醫學院中青年科研基金資助項目( WK201201)。

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0008-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:O657.72; R338.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.003