替莫唑胺、紫杉醇對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用效果觀察

梁會娟，梁海乾，涂悅，程世翔，周欣，姬文杰，魏向陽，蘇景良，張賽( 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070;武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院)

替莫唑胺、紫杉醇對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用效果觀察

梁會娟1，梁海乾2，涂悅2，程世翔2，周欣2，姬文杰2，魏向陽2，蘇景良2，張賽2
( 1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070;2武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要:目的探討替莫唑胺( TMZ)、紫杉醇( PTX)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用效果。方法將不同濃度的PTX或TMZ作用U87細(xì)胞24 h，確定兩藥的半數(shù)抑菌濃度( IC50)。PTX( IC50)、TMZ( IC50)單藥及聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞24、48、72 h，采用CCK-8試劑盒檢測各時間點(diǎn)細(xì)胞生長抑制率。結(jié)果PTX的IC50為0.5 ng/mL，TMZ的IC50為5 μg/mL。與PTX或TMZ單藥作用24、48 h比較，PTX + TMZ作用下細(xì)胞生長抑制率均降低( P均＜0.01) ;與TMZ單藥作用72 h比較，PTX + TMZ作用下細(xì)胞生長抑制率升高( P＜0.05)。結(jié)論

TMZ聯(lián)合PTX作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞48 h內(nèi)，兩藥表現(xiàn)為拮抗作用。作用72 h，與TMZ單藥作用相比，兩藥聯(lián)合有協(xié)同作用;但與PTX單藥比較，該協(xié)同作用不明顯。

關(guān)鍵詞:神經(jīng)膠質(zhì)瘤;替莫唑胺;紫杉醇;協(xié)同作用;拮抗作用

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是腦部最常見的惡性腫瘤［1］，目前主要采用手術(shù)同步放化療方案治療，但總體有效率不高。替莫唑胺( TMZ)為膠質(zhì)瘤化療方案中一線用藥，但隨著治療時間的延長，其療效降低，耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。紫杉醇( PTX)曾廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等治療，但長期用藥出現(xiàn)的劑量相關(guān)的毒性反應(yīng)及過敏現(xiàn)象嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)，TMZ、PTX耐藥均與p53有關(guān)［2，3］。但兩藥聯(lián)合是否能夠發(fā)揮協(xié)同作用，目前尚不確定。2012年10月～2013年1月，本研究觀察了TMZ、PTX對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用效果。

1　材料與方法

1.1材料神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，PTX、TMZ(美國Sigma公司)，CCK-8試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)U87細(xì)胞在含10%胎牛血清的HDMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng);以0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3 d傳代1次。

1.3 TMZ、PTX半數(shù)抑菌濃度( IC50)確定及細(xì)胞增殖情況檢測①IC50確定:取對數(shù)生長期U87細(xì)胞，按1×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，加入配置好的不同濃度PTX( 1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 ng/mL)或TMZ( 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg/mL)處理細(xì)胞24 h。每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8溶液( 5 mg/mL) 10 μL，使終體積達(dá)到100 μL，移入37℃孵箱中繼續(xù)孵育1 h。以僅含U87細(xì)胞孔為對照孔，僅含培養(yǎng)液孔為空白孔。采用全自動酶標(biāo)儀，在波長450 nm下測定每孔光密度( OD)值，計算細(xì)胞生長抑制率。生長抑制率( %) = ( OD對照－OD藥物)/( OD對照－OD空白)× 100%。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件推算PTX、TMZ的IC50。②細(xì)胞生長抑制率計算:以1×103/孔接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，分別加入PTX、TMZ、PTX + TMZ處理細(xì)胞，PTX、TMZ濃度均為IC50。每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入CCK-8溶液( 5 mg/mL) 10 μL，使終體積達(dá)到100 μL，移入37℃孵箱中繼續(xù)孵育1 h。采用全自動酶標(biāo)儀在波長450 nm下測定每孔OD值，計算細(xì)胞生長抑制率。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用珋x±s表示，比較采用配對t檢驗(yàn)(雙側(cè))。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

PTX的IC50為0.5 ng/mL，TMZ的IC50為5 μg/mL。PTX、TMZ、PTX + TMZ作用24、48、72 h后細(xì)胞生長抑制率比較見表1。

3　討論

TMZ、PTX是膠質(zhì)瘤術(shù)后臨床常用化療藥物。PTX是一種水溶性分子，在胞外以被動擴(kuò)散的形式通過細(xì)胞膜作用于微管系統(tǒng)，通過與微管蛋白N端

31位和217～231位氨基酸結(jié)合，誘導(dǎo)和穩(wěn)定微管蛋白，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期［4］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TMZ是一種脂溶性藥物，它是一種前體藥物，在體內(nèi)不需要經(jīng)過肝臟代謝，正常生理?xiàng)l件下即可經(jīng)過非酶解途徑轉(zhuǎn)化為活性化合物，直接發(fā)揮甲基化DNA的作用，使細(xì)胞周期停滯于G2期［5］。

表1　 PTX、TMZ、PTX + TMZ作用24、48、72 h細(xì)胞生長抑制率比較( %，±s)

表1　 PTX、TMZ、PTX + TMZ作用24、48、72 h細(xì)胞生長抑制率比較( %，±s)

注:與TMZ或PTX單獨(dú)作用24 h比較，*P＜0.01;與TMZ或PTX單獨(dú)作用48 h比較，#P＜0.01;與TMZ單獨(dú)作用72 h比較，▲P ＜0.05。

藥物　生長抑制率24 h　48 h　72 h TMZ　0.83±0.04　0.78±0.01　0.67±0.04 PTX　0.50±0.01　0.87±0.04　0.72±0.01 PTX +TMZ　 0.25±0.01* #　0.20±0.01* #　0.74±0.01▲

本研究中PTX的IC50為0.5 ng/mL、TMZ的IC50為5 μg/mL，5 μg/mL TMZ作用24 h的細(xì)胞生長抑制率較0.5 ng/mL PTX大。產(chǎn)生機(jī)制:①TMZ 比PTX的細(xì)胞外濃度高，膜內(nèi)外濃度梯度大，滲透作用更強(qiáng);②TMZ直接作用于DNA，發(fā)揮殺傷作用; PTX不能直接作用于DNA，而是首先作用于微管系統(tǒng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)Raf-1的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮促凋亡作用［6］。

PTX進(jìn)入細(xì)胞以后，誘導(dǎo)Raf-1/Bcl-2磷酸化，其絲氨酸的270位點(diǎn)被認(rèn)為是PTX誘導(dǎo)Bcl-2磷酸化的主要位點(diǎn)，該位點(diǎn)被丙氨酸取代后，顯著抑制Bcl-2、上調(diào)p53［7］。TMZ發(fā)生甲基化作用后，O6-甲基鳥嘌呤( O6-mG)主要被MGMT修復(fù)，N3甲基腺嘌呤、N7甲基鳥嘌呤主要被N7甲基鳥嘌呤-N3-甲基腺嘌呤-DNA-轉(zhuǎn)葡糖激酶( MPG)修復(fù)，是細(xì)胞內(nèi)堿基切除修復(fù)途徑( BER)的始動因素，且不依賴于MGMT的存在。TMZ還可作用于葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 ( GRP78)，它能夠維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定性，抵抗TMZ誘導(dǎo)的凋亡［8］。研究表明，MPG和MGMT均可上調(diào)p53［9］。在G1期，p53可以調(diào)控p21WAF/C1P1基因，與一系列Cyclin-cdk復(fù)合物結(jié)合，抑制蛋白激酶激活，使高磷酸化的Rb蛋白堆積，引起E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子抑制，細(xì)胞阻滯在G1期［10］;在G2/M期，p53通過下調(diào)Cyclin B1，使細(xì)胞不能進(jìn)入M期［11］;最終導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯，修復(fù)損傷，減少凋亡率。在p53的多聚體中，存在有能夠和DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域本身具有核酸內(nèi)切酶的活性，可以修復(fù)錯配的核苷酸，調(diào)節(jié)核苷酸的內(nèi)切修復(fù)因子XPB和XPD活性;此外，它還可以通過與P21WAF1基因以及CDK1基因結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，TMZ聯(lián)合PTX作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞48 h內(nèi)，兩藥表現(xiàn)為拮抗作用。作用72 h時，與TMZ單藥作用相比，兩藥聯(lián)合有協(xié)同作用;但與PTX單藥比較，該協(xié)同作用不明顯。但是，本研究未觀察兩藥聯(lián)用的不良發(fā)應(yīng)，今后將進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn):

［1］Erin M，Siegel L，Burton Nabors，et al.Prediagnostic body weight and survival in high grade glioma［J］.J Neurooncol，2013，114 ( 1) : 79-84.

［2］Kojima K，F(xiàn)ujita Y，Nozawa Y，et al.Mi 34a attenuates paclitaxel-resistance of hormone-refractory prostate cancer PC3 cells through direct and indirect mechanisms［J］.Prostate，2010，70 ( 14) : 1501-1512.

［3］Martin S，Janouskova H，Dontenwill M.Integrins and p53 pathways in glioblastoma resistance to temozolomide［J］.Front Oncol，2012，( 2) : 157.

［4］Zhang C，Xu YG，Duan XN，et al.Role of granulocyte colonystimulating factor in paclitaxel-induced intestinal barrier breakdown and bacterial translocation in rats［J］.Chin Med J ( Engl)，2011，124( 12) : 1870-1875.

［5］章龍珍，趙麗，劉美艷，等.替莫唑胺對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞的增殖影響［J］.山東醫(yī)藥，2009，49( 25) : 29-31.

［6］Eum KH，Lee M.Crosstalk between autophagy and apoptosis in the regulation of paclitaxel-induced cell death in v-Ha-ras-transformed fibroblasts［J］.Mol Cell Biochem，2011，348( 1-2) :61-68.

［7］Wang EY，Gang HY，Aviv Y，et al.p53 mediates autophagy and cell death by a mechanism contingent on bnip3［J］.Hypertension，2013，62( 1) : 70-77.

［8］Song SS，Xing GC，Yuan L，et al.N-methylpurine DNA glycosylase inhibits p53-mediated cell cycle arrest and coordinates with p53 to determine sensitivity to alkylating agents［J］.Cell Res，2012，22( 8) : 1285-1303.

［9］Kitange GJ，Mladek AC，Carlson BL，et al.Inhibition of histone deacetylation potentiates the evolution of acquired temozolomide resistance linked to MGMT upregulation in glioblastoma xenografts ［J］.Clin Cancer Res，2012，18( 15) : 4070-4079.

［10］Zhou Q，Zhu M，Zhang H，et al.Disruption of the p53-p21 pathway inhibits efficiency of the lytic-replication cycle of herpes simplex virus type 2 ( HSV-2)［J］.Virus Res，2012，169( 1) : 91-97.

［11］Hoffmann TK，Trellakis S，Okulicz K，et al.Cyclin B1 expression and p53 status in squamous cell carcinomas of the head and neck ［J］.Anticancer Res，2011，31( 10) : 3151-3157.

［12］史惠榮，張瑞濤.P53、P21WAF1和CDK1在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及意義［J］.癌癥雜志2009，28( 8) : 882-885.

·臨床研究·

收稿日期:( 2014-10-24)

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0034-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R739.4

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.012