雌激素對兔缺血再灌注損傷視網膜神經節細胞凋亡的影響及其機制探討

葛嫣然，邵宏超，王福海(河北聯合大學附屬醫院，河北唐山063000;青縣人民醫院)

雌激素對兔缺血再灌注損傷視網膜神經節細胞凋亡的影響及其機制探討

葛嫣然1，邵宏超1，王福海2
(1河北聯合大學附屬醫院，河北唐山063000;2青縣人民醫院)

摘要:目的觀察雌激素對兔缺血再灌注損傷視網膜神經節細胞凋亡的影響，并探討其作用機制。方法55只健康純種大耳白兔隨機分為假手術組(n=5)、缺血組(n=25)和治療組(n=25)。治療組皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，共7 d;缺血組給予等量生理鹽水皮下注射。假手術組僅進行前房穿刺，缺血組與治療組建立缺血再灌注模型。各組于再灌注后3、6、12、24、72 h，通過TUNEL法檢測視網膜組織神經節細胞凋亡，免疫組化SABC法檢測視網膜組織Caspase-3。結果假手術組各時間點視網膜組織均未見神經節細胞凋亡和Caspase-3陽性表達。與缺血組比較，治療組視網膜神經節細胞凋亡陽性細胞數、Caspase-3陽性細胞數在再灌注后各時間均降低，其中12、24、72 h有統計學差異(P均＜0.01)。結論雌激素可通過降低缺血再灌注損傷時Caspas-3表達，抑制視網膜神經節細胞凋亡，實現其對視網膜缺血再灌注損傷的治療作用。

關鍵詞:視網膜;缺血再灌注損傷;雌激素;視網膜神經節細胞;含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶;凋亡

視網膜缺血再灌注損傷是臨床常遇到的眼科病理改變形式之一，常見于視網膜血管阻塞性疾病、青光眼、眼科手術、眼外傷等，可以導致視網膜神經組織的損傷，引起視力障礙甚至失明。目前，視網膜缺血再灌注損傷的確切發病機制尚不完全清楚，最近研究發現，凋亡是視網膜缺血再灌注損傷神經細胞死亡的主要形式之一［1］，也是視網膜神經細胞變性的最后共同途徑。2012年6月～2013年8月，本研究建立了兔視網膜缺血再灌注損傷模型，通過觀察雌激素對兔缺血再灌注損傷視網膜神經節細胞凋亡的影響，分析其治療機制，旨在為指導臨床治療提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料55只健康純種大耳白兔，購于北京實驗動物中心，隨機分為假手術組(n=5)、缺血組(n=25)、治療組(n=25)。苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，Caspase-3抗體、SABC試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、DAB顯色劑、多聚賴氨酸、枸櫞酸緩沖液、PBS(武漢博士德生物工程有限公司)，氯霉素滴眼液(唐山紅星藥業有限公司)，紅霉素眼藥膏(唐山紅星藥業有限公司)，平衡鹽溶液(河北天成藥業有限公司)，倍諾喜滴眼劑(日本參天制藥株式會社)，托品酰胺滴眼劑(北京雙鶴現代醫藥技術有限責任公司)，4%多聚甲醛(天津傲然精細化工研究所)，20%烏拉坦(天津傲然精細化工研究所)，中性樹脂(唐山醫療試劑公司)乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木素、0.5%鹽酸乙醇、1%氨水(河北聯合大學病理教研室)，3%過氧化氫水溶液(天津灝洋生物技術公司)。

1.2方法

1.2.1治療方法治療組皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg，缺血組給予等量生理鹽水皮下注射，共7 d。

1.2.2缺血再灌注損傷模型制作假手術組僅進行前房穿刺，缺血組與治療組建立缺血再灌注模型，以20%烏拉坦5 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，兔眼滴用倍諾喜表面麻醉。復方托品酰胺滴眼液散瞳后，將連接生理鹽水的5號頭皮針從耳前方角鞏膜緣內刺入前房，緩慢升高輸液瓶高度產生16.7 kPa壓力，觀察并監測眼睛情況。缺血時可見球結膜蒼白、虹膜迅速變白，檢眼鏡檢察可觀察視網膜蒼白水腫，說明視網膜中央動脈的供血已被完全阻斷。60 min后逐漸降低輸液瓶高度，緩慢降低眼內壓，恢復視網膜血供。假手術組，復方托品酰胺滴眼液散瞳后，用5號頭皮針從耳前方角鞏膜緣內刺入前房，之后緩慢拔除針頭。

1.2.3標本制作各組于再灌注損傷后3、6、12、

24、72h耳緣靜脈快速注入空氣栓塞處死，迅速摘除眼球，置于4%多聚甲醛固定24 h;去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體，將后段眼環再固定4 h，進行梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，包埋，切片。

1.2.4視網膜神經節細胞凋亡檢測采用TUNEL法。每只眼球取2張切片進行分析，用圖像分析計數系統對凋亡神經節細胞切片進行圖像分析。在圖像分析儀上對待測樣本取樣，在視網膜切片中央部位向兩側各取2個連續不重疊的高倍視野，分別計數陽性細胞數，計算平均數。

1.2.5視網膜Caspase-3表達檢測采用免疫組化SABC法。按試劑盒說明進行操作，細胞質染成棕黃色為蛋白陽性表達。在視網膜切片中央部位向兩側各取2個連續不重疊的高倍視野(HP)，計數每個視野陽性細胞數，計算平均數。

1.2.6統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料用珋x±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組視網膜神經節細胞凋亡比較假手術組各時間點均無視網膜神經節細胞凋亡;缺血組與治療組各時間點視網膜神經節細胞凋亡比較見表1。

表1　缺血組與治療組缺血再灌注后不同時間點視網膜神經節細胞凋亡比較(個，±s)

組別　n視網膜神經節細胞凋亡3 h　6 h　12 h　24 h　72 h缺血組　25　9.60±2.37　16.00±2.91　22.90±3.70　33.70±6.73　23.20±3.82治療組　25　7.20±3.12　12.80±3.16　17.30±3.68　20.00±2.71　17.90±3.67 t 1.94　2.36　3.39　5.97　3.16 P 0.068　0.030　0.003　0.000　0.005

2.2各組視網膜組織Caspase-3陽性細胞表達比較假手術組未見Caspase-3陽性細胞表達，缺血組與治療組各時間點視網膜組織Caspase-3陽性細胞表達比較見表2。

表2　缺血組與治療組缺血再灌注后不同時間點視網膜組織Caspase-3陽性細胞比較(個，±s)

組別　n Caspase-3陽性細胞3 h　6 h　12 h　24 h　72 h缺血組　25　15.90±2.33　28.80±4.24　55.20±6.07　101.60±11.44　61.80±8.05治療組　25　14.10±1.79　21.10±3.31　44.80±7.08　72.50±5.93　48.20±8.66 t 1.94　4.53　3.53　7.14　3.64 P 0.069　0.000　0.002　0.000　0.002

3　討論

雌激素是一類維持機體正常生理狀態的重要性激素。動物實驗及臨床研究結果顯示，雌激素對急性缺血、缺氧性神經損傷具有明顯的神經保護作用［2～8］。Nonaka等［9］發現，炎癥反應參與了大鼠視網膜缺血再灌注損傷過程，應用雌激素后白細胞在缺血視網膜內聚集減少約35.7%，再灌注時神經組織損傷程度也明顯減輕，表明雌激素可以減輕視網膜缺血再灌注損傷時的炎癥反應。代艷等［10］觀察大鼠缺血再灌注前后視網膜內層厚度，采用TUNEL法檢測視網膜組織中凋亡細胞的表達，發現雌激素治療組視網膜內層萎縮變性程度較輕，神經節細胞凋亡數量減少，表明雌激素對缺血再灌注損傷具有保護作用。

本研究采用TUNEL法觀察視網膜神經節細胞凋亡的變化，用免疫組化方檢測了兔視網膜缺血再灌注后Caspase-3表達變化。結果發現，假手術組未見視網膜神經節細胞的凋亡;缺血組在缺血再灌注后6 h凋亡細胞表達逐漸增多，至24 h達高峰，72 h凋亡細胞明顯減少;治療組各時間點細胞凋亡數量均較缺血組明顯減少，這一變化基本符合國內外文獻報道的細胞凋亡出現的規律，也證實了細胞凋亡與視網膜缺血再灌注損傷密切相關［11～15］。說明雌激素能夠減少視網膜缺血再灌注后視網膜神經節細胞的凋亡。Caspases是一組對底物門冬氨酸有特異水解作用的蛋白酶，至今己發現15個家族成員，其中多數的Caspases與細胞凋亡密切相關［16，17］。本研究中，假手術組未見Caspase-3陽性細胞表達;缺血組Caspase-3在缺血再灌注3 h即開始少量表達，至12 h表達明顯，主要位于神經節細胞層和內核層，24 h達到高峰，以神經節細胞層和內核層為著，外核層亦可見少量表達，再灌注72 h Caspase-3表達明顯下降;治療組再灌注6 h Caspase-3開始少量表達，12～72 h表達變化趨勢基本同損傷組，但各時間段Caspase-3陽性細胞的表達明顯減弱，兩組再灌注12、24、72 h比較有統計學差異。表明雌激素可以下調Caspase-3的表達，減輕細胞凋亡。Jover等［18］在動物大腦缺血性模型中也發現，雌激素可抑制Caspase-3的活性，從而阻斷了凋亡信號級聯，抑制細胞凋亡。

綜上所述，雌激素可以通過下調Caspase-3的表達，減輕視網膜缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡，對視網膜缺血再灌注損傷起到保護作用，但相關雌激素給藥劑量及方式需進一步探討。

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(收稿日期:2014-08-28)

通信作者:邵宏超，E-mail: shaohongchao@126.com

基金項目:河北省唐山市科技計劃項目(12140209A-47)。

文章編號:1002-266X(2015) 20-0028-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R774.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.009