外周血單核細胞miRNA-146a與冠狀動脈病變復雜性的關系

陳麗媛，符春暉，嚴華，陸永光，黃軍章

(欽州市第二人民醫院，廣西欽州535000)

近年來研究發現，miRNAs在包括細胞內信號轉導、動脈粥樣硬化以及腫瘤等多種生物學和疾病過程中發揮重要作用［1～4］。研究發現，miR-146a 在炎癥、免疫相關的疾病中均明顯上調，且與動脈粥樣硬化性疾病密切相關［5，6］。因此，miR-146a 可能作為一種有臨床診斷價值的炎癥因子，為動脈粥樣硬化性疾病的診斷提供新的方法。到目前為止，國內外研究尚無miR-146a與冠狀動脈病變復雜程度之間相關性的研究。因此，本研究首次對miR-146a與SYNTAX積分之間的相關性進行探討，以期找到新的預測冠狀動脈病變復雜性的診斷因子，為冠心病的診斷及預后評價提供新的方法和思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年3月～2013年12月欽州市第二人民醫院心血管內科住院接受冠狀動脈造影術的患者90例，其中男47例、女43例，年齡(62.04±8.12)歲。根據臨床資料及造影結果將所有納入患者分為冠脈正常組、穩定性心絞痛組、急性冠脈綜合征組，各30例。排除標準:①全身各系統急、慢性感染;②嚴重肝腎功能不全;③風濕性疾病;④自身免疫性疾病;⑥既往行血運重建術;⑦主動脈夾層;⑧心包炎。本研究符合人體試驗倫理學標準，并得到倫理委員會的批準以及患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 入院次日早晨空腹情況下，采集患者外周靜脈血4 mL，肝素鈉抗凝，Ficoll法分離外周血單個核細胞，PBS洗滌，－80℃儲存待檢。

1.2.2 miR-146a檢測 采用 Real-time PCR法檢測miR-146a，嚴格按照總RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)說明書進行RNA提取。取總RNA 10 μL，DEPC 水 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，RNase抑制劑 0.5 μL，miR-146a 逆轉錄引物 0.5 μL，cel-miR-146a逆轉錄引物 0.5 μL，5 × buffer 5.0 μL，M-MLV 1.0 μL，配成總體系后混勻 42 ℃孵育。將獲得的 cDNA按1∶20稀釋，取5 μL;2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，PCR Reverse primer 0.5 μL，PCR forward primer 0.5 μL，雙氧水4 μL混勻。按照95℃ 5 min→95℃ 15 s→65℃ 15 s→72℃ 32 s進行40個循環。結果以PCR管內熒光信號達到最低可檢測值時所經歷的循環數C(T)值表示。miR-146a與內參 U6的相對表達量用2－ΔΔCT表示。

1.2.3 冠狀動脈造影檢查 所有納入患者在住院期間完成冠狀動脈造影檢查，給予至少4個體位觀察左冠狀動脈病變情況，至少2個體位觀察右冠狀動脈病變情況。冠狀動脈病變情況通過SYNTAX積分［7］進行評價。冠狀動脈病變定義為直徑≥1.5 mm的血管目測的管腔直徑狹窄≥50%的病變。每個病變給予相應積分，總的SYNTAX積分即為所有病變積分的總和。冠狀動脈造影最終結果和總SYNTAX積分由我科兩個高級職稱醫師進行評價并通過協商達成一致結論，最終計算并記錄所有患者的SYNTAX積分。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，如果組間方差不齊，則采用Welch法進行組間比較，組間多重比較采用Dunnetts'T3檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 各組mirRNA-146a RNA比較 冠脈正常組、穩定性心絞痛組、急性冠脈綜合征組miR-146a相對表達量分別為 2.50 ± 0.85、2.84 ± 1.06、4.31 ±1.85，P ＜0.01。根據 SNYTAX 積分，進一步將冠心病患者分為低分組(＜23分)和高分組(≥23分)，高分組miR-146a相對表達量明顯高于低分組(4.92±1.41 vs 2.86 ±0.91，P=0.026)。

2.2 相關性分析 對miR-146a RNA相對表達量與SYNTAX積分進行相關性分析，結果顯示，miR-146a相對表達量與SYNTAX積分呈正相關(r=0.588，P ＜0.01)。

3 討論

研究發現，與穩定性冠心病患者相比，急性冠脈綜合征患者的外周血單核細胞中miR-146a表達明顯升高，且與血漿 TNF-α呈正相關［8］。在本研究中，與冠脈正常組、穩定性心絞痛組比較，急性冠脈綜合征患者外周血單核細胞中miR-146a相對表達量明顯升高，提示mic-146a參與的炎癥調控機制可能在動脈粥樣硬化斑塊不穩定中發揮作用。

SYNTAX積分是一種對冠狀動脈病變嚴重程度進行分層的有效方法。研究證實，隨著SYNTAX積分增加，冠心病患者再次血運重建及遠期不良心臟事件增加［7］。因此，本研究中將SYNTAX積分作為冠狀動脈病變嚴重程度的指標。在進一步對miR-146a的研究發現，SYNTAX積分高的患者，miR-146a相對表達量明顯升高，且與SYNTAX積分呈明顯的正相關性，提示miR-146a可能對外周血管疾病的評價具有一定的臨床意義。本研究的創新之處在于首次探討并發現miR-146a與冠狀動脈病變的復雜性之間存在明顯相關性，提示miR-146a在冠狀動脈粥樣硬化發生、發展中發揮調控作用，且有可能作為診斷工具應用于臨床，指導冠心病患者的危險分層及預后評價。不足及局限之處在于，本研究僅僅在miR-146a與冠狀動脈病變之間的相關性進行了簡單分析，對其潛在的調控機制未進行深入研究。此外，由于樣本量的限制，本研究并沒有進一步對miR-146a診斷冠狀動脈病變復雜性的特異性及敏感性進行分析。

在今后的工作中，我們將通過在體動物實驗對miR-146a在動脈粥樣硬化中的機制進行探討。同時在臨床研究中，通過納入更多的患者進行診斷及隨訪，以進一步評價miR-146a對冠狀動脈病變復雜程度的診斷價值及提供更多的預后信息。

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