膜輔助蛋白在自然流產中的表達及其生物學意義

彭　魯, 高玲娟, 鐘天鷹

(1. 南京醫科大學附屬腦科醫院, 江蘇 南京 210029;

2. 南京醫科大學附屬南京市婦幼保健院, 江蘇 南京, 210004)

膜輔助蛋白在自然流產中的表達及其生物學意義

彭魯1, 高玲娟2, 鐘天鷹2

(1. 南京醫科大學附屬腦科醫院, 江蘇 南京 210029;

2. 南京醫科大學附屬南京市婦幼保健院, 江蘇 南京, 210004)

摘要:目的探討膜輔助蛋白(MCP)在自然流產中的表達及其生物學意義。方法采用Real-time PCR和免疫印跡技術檢測MCP基因的mRNA和蛋白質表達水平；采用流式細胞術檢測滋養層細胞的凋亡率，Transwell小室法評估滋養層細胞的侵襲能力。結果MCP在自然流產蛻膜組織中顯著低于人工流產的蛻膜組織；抑制MCP基因表達顯著增加滋養層細胞凋亡，且滋養層細胞侵襲能力顯著減弱。結論MCP在滋養層細胞凋亡中發揮重要作用，并可能由此導致自然流產的發生。

關鍵詞:膜輔助蛋白; 自然流產; 滋養層細胞; 凋亡

自然流產是產科常見病理妊娠之一，其病因復雜。除解剖、內分泌、感染、染色體、遺傳因素外，其中40%～80% 原因不明的自然流產可能與免疫因素有關[1]。已有研究[2]表明，自然流產的發生與蛻膜組織細胞凋亡異常以及補體系統的過度激活有關，但目前對于滋養層細胞表面凋亡調控蛋白在蛻膜組織中的表達和內在調節機制缺乏系統并深入的研究。膜輔助蛋白(MCP)是重要的補體調節蛋白之一，主要功能是抑制補體激活,從而保護宿主細胞免受補體系統的溶解破壞[3]。本實驗旨在探討MCP在滋養層細胞凋亡以及誘發自然流產中的關系及其可能的機制。

1材料與方法

1.1　材料

滋養層細胞株HTR-8/SVneo由杭州赫貝生物有限公司提供，siRNA由武漢晶賽公司合成。收集2009年1月—2011年12月南京醫科大學附屬南京婦幼保健院30例自然流產及人工流產蛻膜組織，取材后立即置于-80°C凍存備用。

1.2　細胞培養

將細胞接種于完全營養液中，每50 mL培養瓶中含5 mL完全營養液(含15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，非必需氨基酸10 ml/L及MEM，pH 7.2)，置于37 ℃, 5%CO2培養箱內培養，待細胞貼壁生長，于3 d后換液，去非貼壁細胞此后每3 d換液1次，當傳代的細胞布滿瓶底時，3～4 d可繼續傳代。

1.3　siRNA (small interference RNA，小干涉RNA)的設計

根據Invitrogen網站(http: //rnaidesigner. Invitrogen. com/sirna)提供的免費軟件設計合成MCP siRNA特異性干擾片段和陰性對照片段。從目標基因開放閱讀框起始密碼子“ATG”下游75至100堿基位置開始，尋找“AA”二連序列后的19個堿基序列作為潛在的siRNA靶位點。選擇GC含量在35%～55%的靶基因序列作為潛在優選，在Genebank數據庫進行Blast分析與其他基因的同源性。將選定的序列和相應的人基因組數據庫進行比較，以排除和其他編碼序列同源的序列，確定其為特異性序列。

1.4　實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)

PCR反應體系為20 μL含1×TaqMan Universal PCR Master Mix (ABI)、0.1 μmol/L熒光標記探針、引物各0.2 μmol/L。實時熒光PCR反應在ABI Prime 7300定量PCR檢測儀上進行，反應參數為50 ℃/2 min，95 ℃/3 min, 95 ℃/15 s，60 ℃/1 min，40個循環，在60 ℃進行單點熒光檢測。選擇熒光檢測模式FAM熒光，對于實驗數據，以下公式進行計算：2-ΔΔCT=2-(CT.gC1qR- CT.actin)Time x + (CT.gC1qR- CT.actin)Time 0.

1.5　免疫印跡

所有蛋白樣品調至等濃度后上樣，取下電泳玻璃夾板，將切好的硝酸纖維素膜置于甲醇5 min，然后置于轉移緩沖液中平衡15 min；將膜從電轉槽中取出，室溫下搖動封閉60 min。將硝纖膜置于一抗稀釋液中，在搖床上37 ℃孵育2 h，將膜放進5 mL相應二抗稀釋液中(按相應比例稀釋, 1∶5 000稀釋)，室溫輕搖1 h。加入顯色液，輕輕晃動定影液定影；用自來水將經過定影處理的X膠片洗凈，晾干。以Bio-Rad凝膠成像分析儀進行灰度掃描，對于實驗數據，以下公式進行計算：目的蛋白/內參蛋白。

1.6　細胞凋亡檢測

胰酶消化對數期細胞，調節其濃度為(1～5)×106/mL, 500～1 000 r/min離心5 min, 棄去培養液。用預冷, 4 ℃無菌的PBS充分洗滌細胞2次，用250 μL結合緩沖液重新懸浮細胞。用100 μL的細胞懸液重懸細胞，于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 20 μg/mL的PI溶液，混勻后室溫下避光孵育10～15 min。孵育后加入400 μL結合緩沖液，立即上流式細胞儀分析(實驗必須在1 h內完成)。流式細胞儀分析：流式細胞儀激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的帶通濾器(band pass filter)檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.7　細胞遷移實驗

采用 Corning公司8 μm孔徑的聚碳酯膜Transwell小室(24孔板 )，在 Transwell小室的下室中預先加600 μL含20% FBS的RPMI 1640培養基, 37 ℃平衡1 h，細胞用 PBS洗3次；消化后重懸于含10% FBS的RPM I 1 640培養基中，取細胞懸液100 μL加入至上室。37 ℃、 5%CO2條件下培養24 h，取出Transwell小室，用棉棒擦凈未穿透微孔濾膜的細胞；PBS沖洗后用4%福爾馬林固定，行Giemsa染色，顯微鏡(×200)下隨機計數濾膜下表面5個視野的細胞數，以遷移細胞的數目來表示細胞的遷移能力。

1.8　統計學方法

所得數據以均數±標準差表示，采用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1　MCP在自然流產和人工流產蛻膜組織中的表達水平

采Real-time PCR和免疫印跡法檢測脫膜組織中MCP mRNA和蛋白的表達水平。結果顯示，自然流產脫膜組織中MCP的mRNA和蛋白質水平分別為(0.32±0.11)和(0.22±0.09)，較人工流產脫膜組織中的(0.91±0.07)和(0.62±0.12)顯著減少(P<0.05)。

2.2　沉默MCP基因對滋養層細胞凋亡及侵襲能力的影響

MCP siRNA載體和空質粒載體轉染滋養層細胞48 h后，結果顯示， MCP siRNA組細胞凋亡細胞為(42.39±2.41)，較空載體組(10.53±1.11)顯著增多，而滋養層細胞侵襲能力為(11.1±1.2)，較空載體組(32.5±2.4)顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

3討論

MCP又稱做補體抑制蛋白CD46，其染色體定位于人類1號染色體短臂的32號區，其分子量大小約48～56 ku, 含有4個同源序列(scr)，是一種跨膜蛋白，廣泛分布于組織細胞表面。MCP作為一種重要的補體調節蛋白，主要功能是作為輔助因子促進I因子介導C3b，C4b的降解，抑制補體C3激活的聯級反應，被認為是抑制補體旁路激活的最有效的因子[4-5]。作為防止補體系統過度活躍的主要調節蛋白，補體調節蛋白在防止細胞損傷過程中起著相當大的作用。Girardi等[6]發現Crry基因敲除的小鼠胎兒可以導致小鼠死亡(小鼠Crry基因與人類的MCP作用相似)，并認為原因可能是補體沉積以及由此導致的胎盤感染。

妊娠的成功與否是由多重因素決定的。胎盤蛻膜作為母胎的界面，蛻膜細胞能分泌多種細胞因子，對胚胎著床、妊娠建立與維持，以及分娩發動均起著極為重要的作用。任何破壞胎盤蛻膜細胞因子分泌平衡狀態的原因,都可能給妊娠造成不良影響,引起流產[7]。在本實驗中，發現自然流產婦女胎盤蛻膜組織中的MCP含量明顯減少，提示自然流產的發生可能與MCP蛋白表達降低有關，沉默MCP基因，滋養層系凋亡率顯著增加，且侵襲能力顯著減弱[8-10]。提示失去MCP保護的細胞更容易凋亡，自然流產的發生可能是由于大量胎盤胎膜組織細胞凋亡的結果[11-12]。

綜上所述，MCP有望成為評估自發性流產發生風險的一個重要指標[13-14], 對其展開進一步深入研究，掌握其特點可能會為臨床醫生早期發現流產危險，盡早采取措施保護母胎健康提供一種新的方法。

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Expression of membrane cofactor protein in

patients with spontaneous abortion and its

biological significance

PENG Lu1, GAO Lingjuan2, ZHONG Tianying2

(1.NanjingBrainHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210002;

2.NanjingMaternalandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedical

University,Nanjing,Jiangsu, 210004)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression of membrane cofactor protein (MCP) in patients with spontaneous abortion and its biological significance. MethodsThe expression of MCP mRNA and protein was detected by real-time PCR and Western blot, and meanwhile the effect of MCP on the placenta decidual tissue was measured by Transwell, and the apoptosis rate of trophoblast cell was evaluated by FCM. ResultsThe results showed that the expression of MCP on placenta decidual tissue reduced significantly in patients with spontaneous abortion, while the suppression of MCP might reduce the apoptosis rate and invasion ability of trophoblast cell. ConclusionThe expression of MCP plays an important role in apotosis of trophocyte, which might be the cause of the spontaneous abortion.

KEYWORDS:membrane cofactor protein; spontaneous abortion; trophocyte; apotosis

通信作者:高玲娟, E-mail: gaolingjuan@njmu.edu.cn

收稿日期:2015-03-09

中圖分類號:R 714.21

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)19-055-03

DOI:10.7619/jcmp.201519016