糖尿病大鼠肝臟組織中氧化應激標志物的表達變化及意義

牟忠卿，李曉博，陳麗

(1衛生部北京醫院，北京 100730；2 山東大學第二醫院；3山東大學齊魯醫院)

·基礎研究·

糖尿病大鼠肝臟組織中氧化應激標志物的表達變化及意義

牟忠卿1，李曉博2，陳麗3

(1衛生部北京醫院，北京 100730；2 山東大學第二醫院；3山東大學齊魯醫院)

摘要：目的觀察糖尿病大鼠肝臟組織中氧化應激標志物的表達變化，并探討其意義。方法36只Wistar大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、糖尿病維持組(DM組)、糖尿病治療組(DT組)。DM組、DT組按60 mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素進行造模，NC組注射等量檸檬酸緩沖液。造模成功后，DM組大鼠皮下注射魚精蛋白鋅胰島素(PZI)2～4 U/2 d，DT組皮下注射PZI 9～12 U/(kg·d)，NC組則注射等量的生理鹽水。12周后，檢查各組大鼠體質量、血糖、血脂、肝功能，比色法測定各組大鼠肝臟組織中總超氧化物歧化酶(TSOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(TAOC)、丙二醛(MDA)，并對各組大鼠肝臟組織進行HE、PAS染色和硝基酪氨酸(NT)免疫組化染色。結果12周后，與NC組、DT組相比，DM組大鼠TC、TG、ALT、AST水平增高，大鼠肝臟組織MDA水平、TAOC、TSOD活性、CAT活性、GSH-Px活性增高(P均<0.05)。DM組大鼠肝臟組織存在脂肪變性，PAS陽性的糖原顆粒少且分布不均勻，而在DT組中這些病變明顯改善。NT在DM組的表達較NC組、DT組強(P均<0.05)。結論糖尿病大鼠肝臟組織中氧化應激增強，治療后減輕，氧化應激可能是導致大鼠肝臟組織受損的機制之一。

關鍵詞：糖尿病；肝損傷；氧化應激；抗氧化酶

糖尿病慢性并發癥不僅包括腎臟、心肌、視網膜、神經病變，肝臟亦為長期高血糖的靶器官之一[1,2]。同時，肝臟又對糖尿病和高血糖有重要影響，肝臟通過糖原的合成與分解來調節葡萄糖代謝，影響血糖水平。此外，肝臟在體內氧化和抗氧化作用中均起重要作用[3]，肝臟具有豐富的抗氧化酶類及抗氧化物質，通過氧化還原反應影響營養物質、藥物代謝，而氧化應激在糖尿病長期慢性并發癥中起著關鍵作用。本研究觀察了糖尿病大鼠肝臟組織中氧化應激標志物的表達變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑健康雄性Wistar大鼠36只，體質量200～250 g，購于山東大學動物實驗中心。鏈脲佐菌素(STZ)檸檬酸溶液購于Sigma公司；各種抗氧化酶活性、總抗氧化能力(TAOC)、丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；HITACH U-2000分光光度計購于日立公司；硝基酪氨酸(NT)免疫組化試劑盒購于Cayman公司；HPIAS-1000生物醫學圖像分析系統購于華中科技大學；DCA2000購于德國拜耳公司。

1.2動物分組及處理將大鼠隨機分為正常對照組(NC組，10只)、糖尿病維持組(DM組，14只)、糖尿病治療組(DT組，12只)。DM組、DT組大鼠按60 mg/kg一次性腹腔注射STZ檸檬酸溶液，72 h后尾靜脈全血血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型造模成功；NC組則注射等量檸檬酸緩沖液。造模成功后，DM組皮下注射魚精蛋白鋅胰島素(PZI)2～4 U/2 d，而DT組皮下注射PZI 9～12 U/(kg·d)，NC組則注射等量的生理鹽水。

1.3觀察方法大鼠每周稱體質量，喂養12周后處死，迅速心臟穿刺取血，采用自動生化分析儀測定血糖、TC、TG、ALT、AST等，采用DCA2000儀器測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。取大鼠的肝臟，稱重。取大鼠肝臟組織0.1 g，制成10%勻漿液，保存于-20 ℃冰箱中。采用HITACH U-2000分光光度計用比色法測定各組大鼠肝臟組織中總超氧化物歧化酶(TSOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性以及TAOC、MDA水平。取部分肝臟組織固定于10%的甲醛溶液中，對肝臟組織進行HE染色、PAS染色，并采用Cayman公司小鼠抗大鼠NT單克隆抗體行肝臟組織NT免疫組化染色，用HPIAS-1000生物醫學圖像分析系統測試光密度(OD)進行分析。

2結果

各組大鼠體質量、血糖、血脂水平比較見表1，肝臟質量、肝臟功能水平比較見表2，抗氧化酶活性、TAOC及MDA水平比較見表3。HE染色可見，NC組肝小葉結構正常，肝細胞索清晰，肝細胞排列整齊、規則，肝細胞胞質嗜酸性，核圓居中，染色質疏松，核膜和核仁清楚，肝細胞無變性；DM組肝組織結構紊亂，肝細胞混濁腫脹，肝竇變寬，部分肝細胞脂肪滴明顯增多，為輕度脂肪變性；DT組肝臟組織結構較DM組結構整齊，細胞脂肪變性減輕，無明顯的炎性細胞浸潤。PAS染色可見，NC組中肝細胞胞漿內紅色糖原顆粒較多，分布相對較均勻；DM組肝細胞胞質中紅色糖原顆粒明顯減少，并且分布極不均勻，脂肪變性多見；DT組肝細胞內PAS陽性顆粒較DM組明顯增多，分布較均勻。肝臟組織中NT染色見于細胞的胞質中。NC組、DM組、DT組肝臟組織NT免疫組化的OD值分別為0.067 4±0.005 3、0.117 1±0.006 2、0.069 7±0.006 2，DM組與NC組、DT組比較，P均<0.05。NC組、DM組、DT組肝臟NT陽性細胞百分數分別為21.37%±5.00%、78.62%±16.00%、25.19%±7.00%，DM組與NC組、DT組比較，P均<0.05。

注：與同組0周時體質量比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05；與DT組比較，△P<0.05。

注：與NC組比較，#P<0.05；與DT組比較，△P<0.05。

注：與NC組比較，#P<0.05；與DT組比較，△P<0.05。

3討論

綜上可見，糖尿病大鼠肝臟組織中氧化應激增強，一些新藥物在降低血糖的同時，還能夠改善氧化應激水平和肝功能[8,13,14]，這加深了我們對糖尿病與氧化應激之間關系的理解，也為糖尿病肝損傷及其他并發癥的治療提供了新的方向與途徑。

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(收稿日期：2014-06-24)

中圖分類號：R589.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)07-0026-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.009