唑尼沙胺對癲癇大鼠腦組織NO含量的影響及相關性研究

陳芳　王麗輝　劉斌　張靜　王薇　孫素真

作者單位: 050031石家莊市，河北省兒童醫院神經內科

唑尼沙胺對癲癇大鼠腦組織NO含量的影響及相關性研究

陳芳王麗輝劉斌張靜王薇孫素真

作者單位: 050031石家莊市，河北省兒童醫院神經內科

【摘要】目的探討新型抗癲癇藥物唑尼沙胺的作用機制。方法將50只戊四氮致癇大鼠隨機抽取8只為正常對照組，余42只造模成功后，隨機抽取24只作為實驗動物，隨機分為唑尼沙胺組、苯巴比妥組和癲癇模型組，每組8只。監測4組大鼠唑腦組織NO、MDA含量及NOS、SOD的活性變化并觀察大鼠海馬組織結構的改變。結果癲癇組大鼠腦組織NO、MDA含量及NOS活性與正常對照組比較明顯增高(P＜0.05)，SOD活性明顯降低(P＜0.05);唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠腦組織的NO、MDA含量及NOS活性與癲癇組比較明顯降低(P＜0.05)，SOD活性明顯升高(P＜0.05);唑尼沙胺能夠改善癲癇大鼠海馬組織的結構。結論唑尼沙胺通過降低腦組織NO含量而發揮其抗癲癇作用。

【關鍵詞】唑尼沙胺;戊四氮;癲癇;一氧化氮;海馬

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癲癇作為一種特殊的中樞神經系統疾病，人們一直在探尋其治療方法。近年來，國內外眾多學者對NO在癲癇的發病機制中起作用進行研究，并證實其致癇性。為此，我們以戊四氮致癇大鼠作為研究對象，分析各組大鼠腦組織NO含量的變化，探索新型抗癲癇藥物唑尼沙胺的抗癲癇機制，為癲癇治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠50只，體重(250 ±20)g(許可證號: 1310073河北醫科大學實驗動物中心提供)。實驗前先將所有動物在實驗室飼養7 d，以適應環境。從所有實驗動物中隨機抽取8只為正常對照組，剩余42只全部腹腔注射戊四氮制成癲癇模型。在成功的癲癇模型中隨機抽取24只作為本實驗動物，隨機分為唑尼沙胺組、苯巴比妥組和癲癇模型組，每組8只。

1.2方法

1.2.1模型制作:所有致癇大鼠均給予戊四氮溶液45 mg/kg，每24小時腹腔注射1次，注射后均觀察40 min，觀察、記錄致癇大鼠發作的潛伏期、驚厥發作的表現及持續時間。致癇大鼠的癲癇表現形式采用Racine分級評價標準: 0級，無反應;Ⅰ級，濕狗樣抖動和(或)面肌痙攣，如動須、眨眼及節律性咀嚼;Ⅱ級，頸部肌肉的痙攣，出現點頭和(或)甩尾;Ⅲ級，單側前肢痙攣;Ⅳ級，雙側前肢痙攣，站立位出現;Ⅴ級，全身強直、陣攣，失去平衡、跌倒。觀察實驗大鼠在造模過程中出現以上分級中的Ⅳ～Ⅴ級表現，提示戊四氮點燃成功。正常對照組在同期給予同等容量的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.2.2腦電圖監測:從每組實驗大鼠中抽取2只行腦電圖監測:先用10%的水合氯醛35 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠后參照王凈凈等［1］方法固定于固定架上。再用頭皮針樣電極的單極導聯法［2］，連續描記2 min的腦電圖。腦電圖靈敏度20 μV/mm，時間常數為0.1 s。每次記錄前均在彩色顯示器上觀察信號，待信號基線平穩后再將信號存入計算機硬盤。放置電極位置及導聯:單極導聯法;取2根0.5寸針灸毫針為記錄電極分別刺入大鼠頭頂部中線兩側的頭皮下，再將導線連接到腦電圖的信號輸入設備，大鼠尾根部也需要電極的放置，接地。在每只大鼠的第6次癲癇發作時描記腦電圖，先觀察行為學變化，再記錄腦電圖變化。

1.2.3藥物劑量及途徑:造模成功后0.5 h，唑尼沙胺組給予唑尼沙胺45 mg·kg－1·d－1灌胃;苯巴比妥組給予苯巴比妥35 mg·kg－1·d－1灌胃;正常對照組、癲癇組給予同等體積的0.9%氯化鈉溶液。1次/d，于11∶00前給藥，連續給藥14 d。

1.2.4標本的采集:所有動物在試驗2周時稱重后，首先將大鼠以戊巴比妥鈉40 mg·kg－1·d－1腹腔注射麻醉后，仰臥位固定在大鼠手術板上。斷頭取出整塊的腦組織。用吸水紙粘去多余水分，將腦組織稱重，取一側大腦半球經甲醛固定后行病理切片觀察;另一側大腦用0.9%氯化鈉溶液按1 g∶9 ml比例制成10%的腦組織勻漿，取上清液，冰凍－70℃待測。

1.2.5標本的測定:將腦組織上清液從冰箱取出后常溫融化后按照各試劑盒說明書操作步驟進行檢測;

1.2.6病理學觀察:將HE染色的海馬組織切片置于光鏡下觀察。每只動物均取2張組織切片，每張切片均按由CA1、CA2、CA3、CA4的順序隨機觀察5個不重復視野，觀察實驗動物海馬組織的神經元形態和數目分布。

1.3統計學分析應用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以±s表示，先行正態性檢驗，服從正態分布的資料，方差齊性檢驗后，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，2組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1癲癇大鼠的特征共給42只SD大鼠注射戊四氮，其中有2只大鼠有Ⅴ級發作持續10 min以上而死亡，占戊四氮致癇大鼠的4.8%。所有大鼠均在第1次腹腔注射戊四氮后出現Ⅲ級及以上驚厥發作，表現為點頭、前肢痙攣性抽動及點頭等癥狀。隨著實驗的進行，致癇大鼠的發作癥狀逐日加重。其中90%的實驗動物可在第2次注射戊四氮后，表現出雙側前肢抬起和(或)陣攣性抽動，甚至直立位;提示致癇大鼠的發作級別已經達到RacineⅣ級及以上。第3次戊四氮腹腔注射后，5只未達RacineⅣ級發作。最終35只大鼠點燃成功，占所有致癇大鼠的83%。正常對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液14 d，無癲癇發作;癲癇模型組腹腔注射每日腹腔注射戊四氮維持癲癇發作。其癲癇發作在戊四氮腹腔注射3～5 min開始出現，首先表現為凝視不動、咀嚼、吸鼻，提示癲癇行為Racine分級Ⅰ～Ⅱ級，持續5 min出現反復的咀嚼、面部抽搐及前肢抖動、后退、站立跌倒和旋轉等，提示Racine癲癇行為分級Ⅲ～Ⅳ級，發作間期逐漸縮短，發作期逐漸延長;唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠發作級別降低、潛伏期延長，持續時間縮短，具有一定抗癲癇作用。但觀察唑尼沙胺與苯巴比妥相比較起效慢，給藥4 d后2組大鼠在癲癇發作頻率及發作持續時間上無明顯區別。

2.2腦電圖改變正常對照組的腦電圖表現為低中幅、相對對稱的正常腦電波。戊四氮致癇大鼠腦電圖表現為:基本背景節律下可見陣發性癲癇波。唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠經過藥物干預，腦電波中的棘波減少，背景節律較規整。

2.34組大鼠腦組織NO含量及NOS活性的變化癲癇模型組大鼠經腹腔注射戊四氮14 d后，測定NO的含量及NOS活性明顯升高，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);唑尼沙胺組和苯巴比妥組與癲癇模型組大鼠比較，其NO含量及NOS活性明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1　4組大鼠腦組織NO含量及NOS活性比較n =8±s

表1　4組大鼠腦組織NO含量及NOS活性比較n =8±s

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與癲癇組比較，#P＜0.05

組別　NO(μmol/g)　NOS(U/mg)正常對照組4.01±0.25　0.21±0.02癲癇模型組　11.79±1.03*　0.58±0.05*唑尼沙胺組　7.72±0.92#　0.34±0.05#苯巴比妥組　6.28±0.44#　0.26±0.02#

2.44組大鼠腦組織MDA含量、SOD活性的變化癲癇模型組造模成功后，MDA含量明顯升高，SOD含量明顯減少，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05);唑尼沙胺組和苯巴比妥組與癲癇模型組大鼠比較，其腦組織的MDA明顯減少，SOD含量明顯升高，差異具有統計學意義(P＜0.05 )。見表2。

2.5病理正常對照組大鼠海馬CA3區神經元排列密集、規則，腦組織未見明顯損害。而癲癇組海馬神經元排列紊亂、疏松，可見腦組織壞死性改變，以海馬CA1、CA3區明顯;表現神經元變性和固縮性壞死。變性的神經元腫脹，體積增大。有典型的多角型變為圓

表2　4組大鼠MDA含量和SOD活性水平比較n =8±s

表2　4組大鼠MDA含量和SOD活性水平比較n =8±s

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與癲癇模型組比較，#P＜0.05

組別　MDA(nmol/mg)　SOD(U/mg)正常對照組4.3±0.5　53.6±2.5癲癇模型組　15.0±1.4*　23.0±1.9*唑尼沙胺組　9.5±1.2#　33.9±2.7#苯巴比妥組　7.3±0.7#　38.8±3.5#

形或三角形，胞體偏位;壞死的神經元胞漿濃縮，深染，核仁不明顯，核固縮、核破裂。唑尼沙胺組及苯巴比妥組大鼠海馬神經元經藥物干預均較癲癇組神經元排列整齊、密集，細胞形態規則。見圖1。

圖1　4組大鼠海馬病理(HE×10)

3　討論

癲癇作為一種長期反復發作的慢性神經系統疾病，人們對癲癇發病機制及治療的研究，主要依靠動物模型。戊四氮作為一種興奮中樞神經系統的藥物，根據其藥代動力學特點，此藥物可以引起動物抽搐的迅速發生。并且這種抽搐發作可以迅速達到高峰，持續較短，能自動停止，同時此模型具有不破壞局部腦組織的結構，不伴有神經元損傷、壞死的優點［3］，有利于癲癇腦組織形態學的觀察。因此戊四氮致癇的動物模型是研究癲癇的理想動物模型［4］。

目前治療癲癇的基本方法仍是口服抗癲癇藥物。傳統的抗癲癇藥物如苯妥英、卡馬西平、丙戊酸等均因長期服用出現較大的毒性，并且可能存在肝酶代謝異常、半衰期短及產生活性代謝產物等，其副作用較嚴重，所以在臨床上的應用受到限制［5］。唑尼沙胺是一種新型廣譜抗癲癇藥，無傳統大多數AEDs所含有的酰腺結構，具有獨特的化學結構和廣譜的抗癲癇活性［6］。唑尼沙胺作為在難治性部分性發作的癲癇患者添加治療及單藥已顯示出其有效性［7，8］，長期治療也持續有效［9，10］，且相對于傳統抗癲癇藥物副作用小。已發現此藥物可通過多種作用機制發揮治療癲癇的作用，主要包括: (1)抑制電壓依賴性鈉離子通道; (2)降低T-型鈣離子內流［11］; (3)直接改變一些神經遞質的合成、釋放和降解，如GABA、多巴胺、5-HT和乙酰膽堿，這些作用可以增強突觸抑制。但是，NO及氧自由基在唑尼沙胺抗癲癇作用機制中的作用，筆者尚未見有報道。

本實驗通過監測腦組織NO含量、NOS活性，證實了癲癇發作后NO含量升高，引起海馬組織損傷;經過唑尼沙胺及苯巴比妥治療后海馬損害程度減輕，且腦組織NO含量及NOS活性降低，提示唑尼沙胺可能通過降低腦組織NO含量或NOS活性而發揮其抗癲癇的作用。另外，本實驗中癲癇組大鼠腦組織MDA含量升高，SOD活性降低;而經過唑尼沙胺干預治療的大鼠與癲癇組大鼠相比較，MDA含量降低，SOD活性升高，大鼠海馬組織細胞排列緊密、規整，提示唑尼沙胺可能通過降低腦組織MDA含量或提高SOD活性起到其神經保護作用。通過本實驗證實了唑尼沙胺的抗癲癇治療的有效性，并為我們臨床工作中尋找新的抗癲癇藥物及選用合理的抗癲癇藥物提供借鑒。

參考文獻

1 王凈凈，鄧元江，顧星，等.治痛靈對實驗性癲癇大鼠的作用.湖南中醫學院學報，1999，19: 12-14.

2 黃志農，楊茄，陳剛，等.電針和7-峭基唑對癲癇的效應及共與腦內一氧化氮關系.生理學報，1999，51: 508-510.

3 Coulter DA，Mclntyre DC，Loscher W.Animal models of limbic epilepsies: what can they tell us? Brain Pathology，2002，12: 240-56.

4 Louvel J，Heinemann U.Mode of action of Pentetrazole at the cellular level.ReV Electroencephalogr Neuro Physiol Clin，1981，11: 335-339.

5 Bialer M.Adv Drug Deliv Rev.Chemical properties of antiepileptic drugs (AEDs)，2012，64: 887-895.

6 Holder JL，Wilfong AA.Zonisamide in the treatment of epilepsy.Expert Opin Pharmacother，2011，12: 2573-2581.

7 Brodie MJ，Duncan R，Vespignani H，et al.Dose-dependent safety and efficacy of zonisamide: a randomized，double-blind，placebo-controlled study in patients with refractory partial seizures.Epilepsia，2005，46: 31-41.

8 Villanueva V，Serrano-Castro PJ.Zonisamide in the epilepsy treatment: a literature review from add-on therapy to monotherapy.Rev Neurol，2013，56: 429-438.

9 Faught E.Review of United States and European clinical trials of zonisamide in the treatment of refractory partial-onset seizures.Seizure，2004，13: S59-S65.

10 French JA，Ruelle AD.Zonisamide reduces seizure frequency over time in long-term continuation studies.Epilepsia，2002，43: 241.

11 Shahabadi N，Khorshidi A，Mohammadpour M.Investigation of the effects of Zn2 +，Ca2 +and Na+ions on the interaction between zonisamide and human serum albumin (HSA)by spectroscopic methods.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2014，25: 48-54.

Effect of zonisamide on NO content in brain tissue of rats with epilepsy

CHEN Fang，WANG Lihui，LIU Bin，et al.
Department of Neurology，Hebei Provincial Children’s Hospital，Shijiazhuang 050031，China

【Abstract】Objective To investigate the action mechanism of zonisamide as a new antiepileptic drug.Methods Twenty-four rats with epilepsy induced by pentrazol were randomly divided into three groups: zonisamide group，phenobarbital group，epilepsy model group，with 8 rats in each group，at same time，the other 8 normal rats were used as control group.The contents of NO，MDA and activities of NOS，SOD in brain tissues of the rats were detected for the four groups，meanwhile，the changes of hippocampus tissue structure of the rats were observed.Results The contents of NO，MDA and activity of NOS were significantly increased in epilepsy model group，as compared with those in control group (P＜0.05)，however，the activity of SOD was significantly decreased in epilepsy model group (P＜0.05).The contents of NO，MDA and activity of NOS were significantly decreased in zonisamide group and phenobarbital group，as compared with those in epilepsy model group，however，the activity of SOD was significantly increased in both groups (P＜0.05).Furthermore，zonisamide could improve the structure of hippocampus tissue in rats with epilepsy.ConclusionZonisamide plays an antiepileptic role by reducing the contents of NO in rats with epilepsy.

【Key words】zonisamide; pentrazol; epilepsy; NO; hippocampus

(收稿日期:2014－10－15)

通訊作者:王麗輝，050031石家莊市，河北省兒童醫院神經內科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.003

【文章編號】1002－7386(2015)06－0812－03

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 971.6