協同刺激分子B7-H3在自發性流產患者中的表達及生物學意義

李采霞　曹森楊　溫開群　張弘

作者單位: 224002江蘇省鹽城市婦幼保健院(李采霞、曹森楊、溫開群);江蘇大學第二附屬醫院婦產科(張弘)

協同刺激分子B7-H3在自發性流產患者中的表達及生物學意義

李采霞曹森楊溫開群張弘

作者單位: 224002江蘇省鹽城市婦幼保健院(李采霞、曹森楊、溫開群);江蘇大學第二附屬醫院婦產科(張弘)

【摘要】目的研究可溶性B7-H3(sB7-H3)在正常、妊娠、自發性流產和復發性流產外周血血清中的含量，同時研究B7-H3在正常妊娠行人工流產者(孕3個月內)和自發性流產者(流產后3個月內)的絨毛膜和蛻膜表達情況，探討協同刺激分子B7-H3在妊娠免疫中的生物學意義。方法利用ELISA的方法分析sB7-H3在正常未孕者、正常妊娠者、自發性流產者、復發性流產者血清含量。收集正常妊娠行人工流產術組的絨毛膜和蛻膜以及自發性流產組的絨毛膜和蛻膜，通過免疫組化的方法，分析B7-H3在不同組織中的表達情況。結果sB7-H3在正常對照組、妊娠組、自發性流產組、復發性流產組的血清標本的平均含量之間差異有統計學意義(P＜0.05)。人工流產組和自發性流產組中B7-H3在絨毛膜的表達差異無統計學意義(P＞0.05);在蛻膜上的表達人工流產組明顯高于自發性流產組(P ＜0.05); B7-H3在絨毛膜局部表達，在蛻膜組織各處均有表達。結論B7-H3參與了妊娠免疫，并與自發性流產的發生相關。

【關鍵詞】B7-H3;共刺激分子;自發性流產;妊娠

B7-H3，又稱CD276，是免疫共刺激分子B7超家族的成員之一［1，2］。Baxter等［3］從DC的cDNA庫中克隆出B7家族的新成員: B7-H3。序列分析推測B7-H3是個有316個氨基酸的I型跨膜蛋白。含有N末端信號肽，1個IgV樣區，1個IgC樣區，1個跨膜蛋白區和1個45個氨基酸的胞質尾。B7-H3的表達異常與多種疾病如感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤有一定的相關性。而且B7-H3呈現出膜型和可溶性兩種表達形式。為了探討B7-H3與自發性流產的相關性，我們在蘇州大學醫學生物技術研究所制備研制的B7-H3檢測試劑盒的基礎上［4，5］，對正常人、正常妊娠者(3個月內)、自發性流產(流產后3個月內)及復發性流產(流產后3個月內)患者血清中sB7-H3水平進行分析。另外收集了正常早期妊娠行人流術者(孕3個月內)和自發性流產者(流產后3個月內)的絨毛膜蛻膜和組織，通過免疫組化的方法，分析B7-H3在其中的分布，進一步研究其相關性。

1　資料與方法

1.1一般資料本研究收集正常未孕者37例、正常妊娠者123例(孕3個月內)、自發性流產者147例(流產3個月內)、復發性流產者44例(流產3個月內)。平均年齡分別為(23.2±2.9)、(25.9±2.3)、(27.3±2.3)、(28.2±2.3)歲。排除其他基礎疾病。4組年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)。組織標本:收集正常妊娠行人工流產術組的絨毛膜(19例)和蛻膜(20例)以及自發性流產組的絨毛膜(21例)和蛻膜(21例)。行免疫組化分析。以上標本來自2011年8月至2013年7月蘇州大學第二附屬醫院婦產科住院部。

1.2試劑抗人B7-H3單抗ELISA檢測試劑盒(蘇州大學醫學生物技術研究所制備研制);免疫組織化學所用的B7-H3單克隆抗體均由蘇州大學生物技術研究所制備(使用濃度為10 μg/ml);免疫組化分析所用二抗:辣根過氧化物酶標記鼠/兔通用型二抗(即用型，福州邁新生物科技有限公司);免疫組織化學常用試劑: PBS緩沖液粉劑;檸檬酸抗原修復液; EDTA抗原修復液; BSA(Gene-tech，Co.Ltd);蘇木素體細胞快速染色液; 1%鹽酸-酒精分化液; DAB顯色劑;封片用中性樹膠; 3%H2O2;多聚賴氨酸玻片。

1.3試驗方法

1.3.1血清中sB7-H3標準工作曲線的繪制:以sB7-H3重組蛋白的梯度稀釋液(5 000、2 500、1 250、625、100、50、25、0 pg/ml)濃度為縱坐標，相應的OD值為橫坐標，繪制sB7-H3的標準工作曲線［4，5］。

1.3.2血清中sB7-H3的結果分析:應用已建立的sB7-H3 ELISA檢測方法，對正常人、正常妊娠者(孕3個月內)、自發性流產(流產后3個月內)患者及復發性流產(流產后3個月內)的血清樣本中sB7-H3的含量進行定量分析。

1.3.3免疫組織化學染色:收集正常妊娠行人工流產術組的絨毛膜(19例)和蛻膜(20例)以及復發性流產組的絨毛膜(21例)和蛻膜(21例)，行免疫組化分析。具體標準見表1［6］，總分: X×Y。

表1　免疫組化實驗評分標準

1.4統計學分析采用GraphPad Prism 5軟件，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1B7-H3工作曲線的建立B7-H3標準品蛋白濃度蛋白濃度與OD450值之間具有良好線性關系。檢測范圍為0～5 000 pg/ml。結果顯示相關系數R2=1.0000，其濃度和OD值呈現明良好的相關性。見圖1。

圖1　人可溶性sB7-H3 ELISA檢測試劑盒中的標準曲線

2.2血清樣本中sB7-H3的ELISA結果分析我們的結果顯示:妊娠組血清中sB7-H3的含量為(2 023± 98)pg/ml;復發性流產組為(768±52)pg/ml;正常組為(595±49)pg/ml;自發性流產組為(1 000± 42)pg/ml(表2)。即血清樣本中sB7-H3含量為妊娠組＞自發性流產組＞復發性流產組＞正常對照組(P ＜0.05)。見圖2。

圖2　sB7-H3血清含量分類圖

2.3免疫組化結果分析根據免疫組化的評分標準，我們對B7-H3在組織中的表達進行分析。B7-H3絨毛膜組僅在絨毛膜局部表達，蛻膜組均全部表達。絨毛膜樣本中B7-H3表達平均評分為正常妊娠行人工流產組(1.842±0.491)、自發性流產組(1.550± 0.467);蛻膜標本中B7-H3表達平均評分為妊娠組(3.950±0.626)、流產組(2.286±0.437)。絨毛膜組B7-H3在人工流產(即正常妊娠3個月內)和自發性流產中均有表達，但差異無統計學意義(P＞0.05)。蛻膜組的B7-H3評分在人工流產組顯著高于自發性流產組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2，圖3 ～5。

3　討論

圖3　免疫組化實驗B7-H3在絨毛膜的表達強度

圖4　B7-H3在絨毛膜中表達情況分析

圖5　B7-H3在蛻膜中表達情況分析

表2　蛻膜樣本中B7-H3的評分測定和分析　分，x±s

妊娠相當于同種異體移植，胎兒及其附屬物不被母體排斥并可在子宮內發育成熟，母體必須形成免疫耐受。正常妊娠期，母體免疫功能發生變化，在母-胎免疫微環境中，有多種細胞和細胞因子參與這種免疫調節作用。B7-H2、B7-H3在整個妊娠周期滋養細胞中都有表達。B7-DC、B7-H2和B7-H3在母胎界面的時間、組織空間的差異表達誘導母胎免疫耐受的建立和維持［7－9］。本實驗主要研究B7-H3在母胎界面的免疫耐受。

目前，B7-H3作為協同共刺激分子其協同刺激和協同抑制的作用都有相關研究報道，B7-H3在免疫反應中具有相反功能，可能是歸因于不同細胞的多重受體。故對B7-H3的生物學作用仍存在一定的爭議。sB7-H3在非小細胞肺癌(NSCLC)患者體內水平顯著高于其他肺部疾病者或者健康人，而且sB7-H3的表達水平與患者腫瘤的分化程度、淋巴結轉移以及遠端轉移密切相關。說明sB7-H3是非小細胞肺癌的一個重要生物標記［10］。sB7-H3在正常人和慢性前列腺患者血清中的水平差異無統計學意義(P＞0.05)，但是在慢性前列腺患者的前列腺分泌物中的水平相較于健康人則有顯著性差異。這提示sB7-H3可以作為一個診斷慢性前列腺疾病的指標［4］。Sun等［11］發現，鼠B7-H3不論在體內還是體外，均具有負向調節作用，能夠抑制T細胞的增殖和細胞因子的產生。

本實驗研究B7-H3與自發性流產的相關性，通過ELISA實驗，分析了正常人、正常妊娠者、復發性流產者、自發性流產者的血清中可溶性sB7-H3差異性表達的結果。并再通過免疫組化實驗分析膜型B7-H3在絨毛膜和蛻膜中的表達，進一步證實其相關性。實驗結果表明:外周血血清中sB7-H3含量是正常妊娠者＞自發性流產＞復發性流產＞正常未孕者，我們推測B7-H3是正常人體內存在的一種協同刺激分子，經過妊娠這個特殊的生理過程，其含量急劇升高。復發性流產和自發性流產都是先經歷妊娠過程，而后發生了流產這樣的結局，其外周血中sB7-H3含量都是要高于正常人，而低于正常妊娠者的。復發性流產后，其發生流產的易感性增加，外周血中sB7-H3含量低于自發性流產。根據以上的分析，我們認為B7-H3是對保證正常妊娠過程有積極作用一種因子，可能是因為其在正常妊娠過程中發揮了其負性調節作用，減輕了母體對胎兒的免疫排斥，保證了妊娠的繼續維持。

本實驗結果表明，基于正常妊娠行人工流產者和自發性流產者都是經歷早期妊娠過程的，而絨毛膜是維持早期妊娠的一種重要物質，早期妊娠的絨毛膜局部表達B7-H3。蛻膜是早期妊娠繼續發育后出現的組織，正常妊娠行人工流產者和自發性流產者的B7-H3在蛻膜的表達存在顯著性差異，一定程度上預示了自發性流產的結局發生。B7-H3是妊娠過程中表達量增加的協同刺激因子，其表達量增加的程度也在一定程度上影響了最終的妊娠結果。

綜上，我們認為B7-H3是一種正常表達在人體外周血、絨毛膜和蛻膜的協同刺激因子，隨著妊娠過程的發生，其在外周血中的可溶性sB7-H3含量增加，蛻膜上的膜型B7-H3含量增加，絨毛膜上膜型B7-H3含量無顯著變化。正常妊娠者的外周血中的可溶性sB7-H3含量和蛻膜上的膜型B7-H3含量增加要顯著高于自發性流產者，隨著流產次數的增加，B7-H3的增加幅度減小，一定程度上預示了妊娠的結局走向。這在臨床工作中對流產發生的可能性方面提供警示，對于減少或者避免流產的發生具有積極意義。

參考文獻

1 Jiang L，Liang JY，Jiang MG，et al.Functional polymorphisms in the NBS1 gene and acute lymphoblastic leukemia susceptibility in a Chinese population.Eur J Haematol，2011，86: 199-205.

2 Hakon R，Kimberley JH，Anne M，et al.Primary human acute myelogenous leukemia cells releasematrix metalloproteases and their inhibitors: release profile and pharmacological modulation.Eur J Haematol，2009，84: 239-251.

3 Baxter AG，Hodgk in PD.Activation rules: the two signal theories of immune activation.Nat Rev Immunlo，2002，2: 439-446.

4 Wei X，Zhang G，Yuan H，et al.Detection and quantitation of soluble B7-H3 in expressed prostatic aecretions: a novel marker in patients with chronic prostatitis.J Urol，2011，185: 532-537.

5 Yuan H，Wei X，Zhang G，et al.B7-H3 over expression in prostate cancer promotes tumor cell progression.J Urol，2011，186: 1093-1099.

6 Khorana A，Ahrendt SA，Ryan CK，et al.Tissue factor expression，angiogenesis，and thrombosis in pancreatic cancer.Clin Cancer Res，2007，13: 2870-2875.

7 Hunt JS，Petroff MG，Burnett TG.Uterine leukocytes: key players in pregnancy.Semin Cell Dev Biol，2000，11: 127-137.

8 蔡琳，李大金，孫曉溪，等.孕早期人母-胎免疫耐受機制的研究.中國免疫學雜志，2000，16: 200-202.

9 Hunt JS，Jadhav L，Chu W，et al.Soluble HLA2G circulates in maternal blood during pregnancy.Am J Obstet Gynecol，2000，183: 682-688.

10 Zhang G，Xu Y，Lu X，et al.Diagnosis value of serum B7-H3 expression in non-small cell lung cancer.Lung Cancer，2009，66: 245-249.

11 Sun M，Richards S，Prasad DV，et al.Characterization of mouse and human B7-H3 genes.J Immunol，2002，168: 6294-6297.

Expression and biological significance of costimulatory molecule B7-H3 in patients with spontaneous abortion

LICaixia，CAO Senyang，WEN Kaiqun，et al.
Institute for Maternal and Child Health of Yancheng City，Jiangsu，Yancheng 224002，China

【Abstract】ObjectiveTo observe soluble sB7-H3 levels in serum of peripheral blood in normal women，pregnant women，patients with spontaneous abortion and recurrent spontaneous abortion，and to analyze its expression in chorion and deciduas of artificial abortion women and patients with spontaneous abortion or recurrent spontaneous abortion，and to investigate the biological significance of B7-H3 in order to provide the experimental basis for early diagnosis of spontaneous abortion.Methods The contents of sB7-H3 in serum were detected by ELISA in normal women without pregnancy，normal pregnant women，patients with spontaneous abortion or recurrent spontaneous abortion.The expression levels of B7-H3 in chorion and deciduas of patients with artificial abortion and patients with spontaneous abortion were detected by immunohistochemistry.Results There were significant differences in the serum levels of sB7-H3 among normal control group，normal pregnancy group，spontaneous abortion group，recurrent spontaneous abortion group (P＜0.05).However there were no significant differences in the expression levels of sB7-H3 between artificial abortion group and spontaneous abortion group (P＞0.05).The expression levels of sB7-H3 in deciduas in artificial abortion group were significantly higher than those in spontaneous abortion group (P＜0.05).The expression of B7 could be found in local position of chorion，however，which could found anywhere in deciduas tissue.ConclusionB7-H3 molecule is involved in pregnancy immunization and is correlated to pathogenesis of spontaneous abortion.

【Key words】B7-H3; costimulatory molecule; spontaneous abortion; pregnancy

(收稿日期:2014－10－15)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.006

【文章編號】1002－7386(2015)06－0823－04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 392.12