多酚與蛋白質、消化酶相互作用的研究進展*

劉嬋，何志勇，秦昉，曾茂茂，陳潔

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

在食品工業中，提高食品的營養和功能品質是產品研發和加工制造的主要目標，例如通過結合2種具有生物活性的化合物來開發新型功能性食品，現在許多營養食品就同時含有多酚和乳蛋白，如奶茶、果奶、可可奶和咖啡奶等產品。多酚具有抗癌、消炎和抑菌的功效，也可促進血管生成、預防慢性疾病和動脈粥樣硬化的發生，降低糖尿病、心血管疾病和癌癥的發病率［1］。乳蛋白包括酪蛋白和乳清蛋白，含有人類全部必需氨基酸，營養價值豐富，生物學價值較高，消化率可達98%［2］。許多研究表明多酚與乳蛋白的相互作用會破壞蛋白質的二級結構，從而降低蛋白質的溶解度和消化性，同時也降低了多酚的抗氧化性，影響食品的感官和功能特性［3］，因而探究多酚與蛋白質相互作用對食品營養學和生命科學具有重要意義。由于消化酶對于營養物質的消化吸收具有關鍵作用，但是對于復合體系在機體消化環境中消化酶存在下的競爭作用以及消化酶對復合物營養性和功能性的影響尚不太清楚。因此，研究人體消化環境中在消化酶存在下，多酚與乳蛋白、消化酶相互作用及其對多酚生物利用性和抗氧化性的影響狀況，對于提高產品的營養健康功能具有十分重要的指導意義。

1 多酚和蛋白質相互作用

1.1 相互作用機理

多酚類物質具有與蛋白質選擇性結合的能力，不同多酚對不同蛋白質親和力具有一定差異［4］。多酚是植物的次級代謝產物，由多個羥基基團連接到芳香環上構成［5］。蛋白質包含20種不同的氨基酸，而氨基酸是由一個α-碳原子共價結合一個氫原子、一個氨基、一個羧基和側鏈基團［6］。酚類小分子化合物通過滲入蛋白質分子的內部與肽鏈交聯。多酚與蛋白質的結合分為可逆性和不可逆性，可逆性的結合就是一些非共價作用，包括氫鍵作用、靜電吸附和疏水作用等［7-8］。氫鍵的形成主要是通過多酚中的氫原子與蛋白質中的電負性離子如N、O或S結合;靜電吸附是酚類小分子通過正負離子交換而吸附到蛋白質分子表面，作用力較弱;疏水作用是非極性基團間形成的較強的作用力［4］。不可逆性結合則包括了共價鍵和離子鍵的結合［9-10］。目前，對于多酚與蛋白質間非共價鍵結合的研究較多，而對于共價鍵結合作用研究較少。

1.2 相互作用測定方法

多酚與蛋白質相互作用的親和力、化學計量學、動力學、熱動力學和構象變化等特征參數通常用毛細管電泳法、電噴霧質譜法(ESI-MS)、高性能親和色譜法(HPAC)、核磁共振光譜和多光譜法等方法測定［11］。多光譜法［12］包括熒光光譜法、紅外光譜法、紫外光譜法和圓二色譜法，是測定多酚-蛋白質相互作用的常見方法，在這些方法中，熒光猝滅技術可以確定多酚和蛋白質之間的結合常數和結合位點的數目，方法較為簡單因而得到廣泛應用。Wu等［13］利用熒光猝滅法、圓二色譜法研究發現EGCG和β-乳球蛋白間通過氫鍵和疏水作用緊密結合，同時破壞了β-乳球蛋白的空間結構。Moser等［14］通過熒光猝滅法研究發現乳蛋白與黃烷-3-醇相互作用可以改變黃烷-3-醇的生物有效性，但在胃腸消化環境中會降低特定蛋白質與其相互作用的影響。

1.3 多酚與乳蛋白的相互作用

多酚與乳蛋白的相互作用可改變食品中乳蛋白的營養價值和多酚的功能性質，主要影響多酚的抗氧化性。Dubeau［15］采用不同的抗氧化性測定方法發現，在溶液和固液體系中牛奶將抑制茶多酚的抗氧化性，相反在油濁液中，牛奶會增強茶多酚的抗氧化性，從而認為牛奶中蛋白質對茶多酚的抗氧化性具有雙重影響。Ryan［16］研究表明牛奶可降低茶多酚的抗氧化性，其中脫脂奶對多酚抗氧化性的降低程度高于全脂奶和半脫脂奶。同時Sharma［17］分析發現加入牛奶的黑茶中多酚的抗氧化活性低于黑茶的抗氧化活性。

另外，多酚與乳蛋白的結合會破壞乳蛋白的二級結構，從而影響乳蛋白的功能性質如乳化性、熱穩定性和抗氧化性。Hasni，Kanakis等［18-19］分別對 α、β-酪蛋白和β-乳球蛋白與茶多酚兒茶素衍生物的相互作用進行了研究，利用紅外光譜，紫外可見光，圓二色譜和熒光光譜方法以及分子模型對其結構進行分析表明，多酚與酪蛋白的結合會減少酪蛋白分子的α螺旋和β-折疊，增加其無規則卷曲和回轉，從而改變酪蛋白的二級結構。Wang等［20］研究發現在pH 8.0，60℃的條件下，EGCG與α-乳清蛋白結合可降低溶液的渾濁度，同時也可提高α-乳清蛋白的乳化性，從而增強體系的穩定性。O'Connell等［21］向脫脂奶中分別添加綠茶、黑茶、可可粉和咖啡，發現茶類富含的多酚物質可與乳蛋白相互作用，增強酪蛋白膠束的穩定性，從而增強了脫脂奶在140℃高溫下的熱穩定性。

1.4 多酚與消化酶的相互作用

多酚有多種有益作用，通過清除體內金屬離子或激活抗氧化酶的活性達到保護機體的功能。許多研究表明，多酚中的某些種類還可以通過改變消化酶的活性來對人體產生其他有益效果［22］。多酚可以通過抑制消化酶對脂類和淀粉的分解從而減少熱量的攝入，起到預防肥胖以及維持血糖穩定的作用，達到調節營養成分生物利用性的有益效果。同時某些多酚如原花青素對人體還有抗營養作用，該抗營養作用也是由于原花青素與消化酶之間相互作用的結果。原花青素與消化酶的相互作用主要包括對脂肪酶、蛋白酶以及葡萄糖苷酶的抑制［23］。

多酚對消化酶的抑制作用主要是因為多酚與消化酶的結合，使消化酶分子結構發生變化，致使酶活性降低。Wu等［24］利用熒光光譜法、圓二色譜法和分子對接研究方法測定苦茶中苯丙素苷類化合物與胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等消化酶的相互作用。由于消化酶分子中疏水基團與苯丙素苷類化合物的疏水作用從而使酶分子中極性基團(如-OH、-SH和-NH2基團)與苯丙素苷類化合物中的-OH基團形成氫鍵結合，改變了消化酶的極性，從而抑制消化酶的活性。

多酚對消化酶的抑制作用強弱與多酚含量和種類以及消化酶的種類密切相關。Goncalves等［25］利用分光光度法研究葡萄籽中花青素和不同葡萄酒中單寧對胰蛋白酶的抑制作用，結果表明，多酚的平均聚合程度與對胰蛋白酶的抑制作用有直接關系。此外，不同類型葡萄酒中，因酚類物質含量不同，對胰蛋白酶活性的抑制程度也不同，隨著酚類物質含量的增加對胰蛋白酶活性的抑制作用增強，并且證實了縮合單寧作為抗營養因子，可抑制蛋白質的消化作用，減少營養素的吸收。McDougall等［26］利用體外實驗研究不同漿果中多酚物質對α-淀粉酶的抑制作用，通過測定其IC50值得出樹莓和花楸漿果的抑制效果最好，并利用液相色譜質譜聯用技術分析樹莓和花楸漿果中起抑制作用的成分主要為原花青素，花楸漿果中原花青素與淀粉酶通過疏水作用結合，從而抑制淀粉酶的活性。原花青素對淀粉酶的抑制作用減少了對阿卡波糖(降低血糖的藥)的分解，達到控制人體餐后血糖濃度和預防肥胖的作用。He等［27］測定茶多酚對不同消化酶如α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶的抑制作用，發現茶多酚對α-淀粉酶的抑制作用最強，其次是脂肪酶，最后為胃蛋白酶和胰蛋白酶。

2 消化環境中多酚與乳蛋白的變化及相互作用

2.1 多酚在消化環境中的變化

許多研究表明，多酚在體內代謝吸收過程中對于降低冠狀動脈心臟疾病、癌癥以及胃腸道疾病發病率［28］等方面發揮了重要作用，目前普遍認為多酚的消化吸收主要發生在小腸部位［29］。消化環境中對多酚影響較大的是胃腸道的pH值。綠茶中兒茶素的穩定性與溶液pH密切相關，在pH為3和4時相對穩定，但它在 pH值為5和6時很容易降解［30］。Andrew等［31］在體外模擬消化環境的實驗中已經證明，兒茶素在模擬酸性胃環境中較穩定，在模擬腸道的近中性或堿性pH環境下大幅度降解。而在模擬小腸環境中EGCG和EGC最敏感，ECG較為穩定，EC和C最穩定。消化過程中，兒茶素類衍生物的降解大多發生在小腸環境中，在腸液環境中的損失量通常比胃環境中的損失量高10～20倍。同時，Record等［32］在研究不同品種茶葉在消化環境中的變化也發現，各種茶葉中兒茶素在酸性胃環境的培養幾乎沒有影響，然而在小腸中微堿性pH環境下培養，綠茶和紅茶中兒茶素的濃度迅速下降，且綠茶中兒茶素的損失量高于紅茶。

在消化環境中，多酚的抗氧化性、生物可及性和生物利用率都會受到影響，并且不同種類的多酚經過消化環境，其功能性變化不同。Fereidoon等［33］通過模擬體外消化和微生物發酵研究消化過程對5種不同谷物中酚類物質的抗氧化能力和生物利用性的影響，發現經消化酶的水解作用，谷物抗氧化活性增強，谷物中多酚的生物可及性提高，這是因為消化酶的作用有利于多酚從含有不溶性纖維的谷物中釋放。Tagliazucchi等［34］發現食物中的酚類物質在胃腸消化環境中釋放而被吸收，在胃消化過程中總酚、黃酮類和花青素類的生物可及性增加，而在腸道環境中酚酸和白藜蘆醇降解，兒茶素、槲皮素則相對較穩定。Bermudez-Soto等［35］也對阿龍尼亞苦味果汁中主要多酚化合物在體外胃腸消化環境中的穩定性進行了研究，發現胃的消化對酚類化合物無顯著影響，而酚類在小腸消化過程中的變化較為顯著，其中花青素損失最多(大約43%)，黃酮類和黃烷-3-醇含量分別下降26%和19%，而綠原酸含量增加了24%，并認為食物多酚在小腸消化中的顯著變化主要是因為多酚類化合物在小腸堿性條件中轉變成其他具有不同生物有效性、生物利用度和生物活性的未知化合物。Gian等［36］通過模擬胃腸消化環境，研究血漿蛋白與白茶、綠茶和紅茶中茶多酚的相互作用，發現相對于紅茶和綠茶，白茶中兒茶素衍生物含量最豐富，在腸道中，白茶中兒茶素也具有較高的生物有效性和生物利用度，白茶中EGCG、EGC和ECG的積累量高于綠茶和紅茶，而白茶中EGCG和EGC比ECG和EC更容易消化。

2.2 多酚與乳蛋白在消化環境中的相互作用

有研究提出，食品多酚在消化過程中抗氧化性、生物可及性和生物利用率的變化與多酚和蛋白質相互作用的強弱有很大關系。Xie等［37］利用模擬體外消化環境和Caco-2細胞模型，探究綠茶中添加牛奶對綠茶中兒茶素衍生物有效性和腸道吸收的影響，發現綠茶中ECG和EGCG與牛奶中的蛋白質結合力較強，而EC和EGC的蛋白質親和力較弱，綠茶與牛奶混合液中兒茶素衍生物在Caco-2細胞中的回收率顯著高于無乳的綠茶溶液，并認為是由于乳蛋白與兒茶素的相互作用促進了兒茶素的吸收，從而提高了兒茶素的生物利用度。Green等［38］研究發現茶與谷物奶的混合可使茶中總兒茶素的回收率增加69%，茶中加入50%的大米乳也可使EGC和EGCG的回收率分別達到74.0%和69.7%，而在消化實驗中，觀察到EGC和EGCG顯著下降，而EC和ECG保持其穩定性，Green等認為蛋白質的消化，將破壞兒茶素與蛋白質相互作用使兒茶素衍生物暴露于消化環境中，從而促進了兒茶素衍生物的降解。

食品多酚與乳蛋白相互作用不僅會影響多酚的抗氧化性和生物利用率，也會影響乳蛋白的消化性，進而影響食品復合體系的營養和功能特性。He等［39］研究果奶體系在消化環境中乳清蛋白的消化性，得出在胃消化階段，兒茶素和綠原酸對乳清蛋白的消化性影響不大。在小腸階段，多酚可顯著降低乳清蛋白的消化性，隨多酚濃度的增加抑制效果增強，并且兒茶素對乳清蛋白水解度的抑制作用大于綠原酸。Marija等［40］認為膳食多酚和β-乳球蛋白的結合可降低蛋白質的消化率和體系的抗氧化活性，多酚與蛋白的非共價鍵結合延遲β-乳球蛋白的消化，促使β-乳球蛋白β-折疊向α-螺旋轉變。苑博等［41］也發現酚類物質通過與乳清蛋白以及蛋白酶的相互作用使乳清蛋白的消化率降低，酚類物質濃度越大對蛋白質消化率的影響越大。體外消化過程中，乳清蛋白及乳清蛋白與酚類物質混合物的ABTS自由基清除能力提高，鐵離子還原能力降低，酚類物質與乳清蛋白相互作用對抗氧化性的影響通常不變，蛋白酶對柚皮苷和綠原酸的抗氧化性影響不大，卻降低了兒茶素抗氧化性。

3 展望

在食品工業中，奶茶和果奶是多酚類物質作為功能性配料在含乳食品中應用的典型產品，多酚的加入既可以改善含乳食品的口感，也可以增強其抗氧化活性。本文介紹了近年來乳蛋白與食品多酚相互作用、多酚與消化酶的作用以及多酚、乳蛋白和多酚-乳蛋白復合體系在體外消化環境中變化的研究進展情況。然而目前研究僅僅局限在多酚和乳蛋白、多酚與消化酶、乳蛋白與消化酶兩者之間的作用，而對于在消化環境下食品多酚與蛋白質、消化酶之間到底存在怎樣的競爭相互作用關系，這種競爭相互作用強弱對食品體系抗氧化性、消化性、生物利用性及健康功能會產生什么樣的影響尚不清楚。所以，今后需要進一步從分子水平上分析研究蛋白-多酚、多酚-消化酶在消化環境條件下相互作用的類型、大小及相互競爭關系，并探尋三者相互作用對食品體系蛋白質營養性及多酚功能性的影響規律，這對于提高產品的營養價值和健康功能品質具有重要意義，將為蛋白質-多酚復合類功能性食品的開發利用提供科學依據和重要理論基礎。

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