大孔樹脂純化山杏核殼總黃酮的工藝優化

楊 喆,萬 山,張喬會,寧亞萍,董施彬,王建中

(北京林業大學 林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

大孔樹脂純化山杏核殼總黃酮的工藝優化

楊 喆,萬 山,張喬會,寧亞萍,董施彬,王建中*

(北京林業大學 林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

以山杏核殼為原料，采用大孔樹脂純化山杏核殼提取液中的總黃酮，利用單因素試驗和正交試驗優化D101大孔樹脂純化山杏核殼總黃酮的工藝條件。結果表明:在上樣溶液質量濃度0.3 mg/mL、pH 2、流速2 mL/min的條件下進行純化實驗，大孔樹脂對山杏核殼總黃酮的平均吸附率為75.20%。山杏核殼總黃酮的質量分數可達51.63%，表明D101大孔樹脂對山杏核殼總黃酮有較好的純化效果，且工藝重復性和穩定性良好。

山杏核殼；總黃酮；大孔樹脂；純化

山杏（Prunus armeniaca）屬薔薇目、薔薇科、杏屬植物，是亞洲特有的生態經濟性樹種，主要分布在我國黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、甘肅、河北、山西等地，資源蘊藏量大[1-2]。山杏核殼約占杏核質量的60%，據統計，我國每年山杏產量達250萬 t，加工過程約產生山杏核殼150萬 t[3-6]。這些核殼在加工利用過程中作為廢料被大量丟棄，造成極大的資源浪費。總黃酮化合物在植物中分布廣泛，是植物的次級代謝產物。研究[7-8]表明，黃酮類化合物是一類具有生物活性的物質，在延緩衰老、防治心腦血管疾病等方面具有積極作用，廣泛應用于醫藥、食品等領域。目前對山杏核殼的利用研究主要是黑色素提取[9]、活性炭制備[10]及其總黃酮提取工藝[11]方面的報道，還未見采用大孔樹脂對其黃酮類物質純化的報道。大孔樹脂是20世紀70年代逐漸發展起來的一類具有多孔結構的有機高分子聚合物吸附劑[12-14]。大孔樹脂具有性質穩定、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快等優點，因而被廣泛應用于天然產物的純化[15]。本實驗選取4 種不同類型的大孔樹脂，通過靜態吸附與解吸篩選出相對較優的大孔樹脂，通過單因素試驗和正交試驗優化山杏核殼總黃酮的純化工藝條件，實驗結果能為山杏核殼資源綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山杏核殼購自北京延慶。

蘆丁標準品 國藥集團化學試劑有限公司；大孔樹脂D101、AB-8、D001、HPD400 科百奧生物技術有限公司；無水乙醇、鹽酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA2004電子天平 上海上平儀器有限公司；TD5A臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；DZF真空干燥箱 上海龍躍儀器設備有限公司；SHZ-Ⅲ循環水式多用真空泵 上海知信實驗儀器技術有限公司；R-210旋轉蒸發儀 上海申順生物科技有限公司；SHA-BA水浴恒溫振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司；T6新世紀型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；BS-100A自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山杏核殼提取液的制備

將山杏核殼用粉碎機粉碎，過60 目篩，制成山杏核殼粉。稱取一定量山杏核殼粉末，按液料比12∶1(mL/g)加入60%乙醇溶液，用閃式提取器閃提4 min，多次提取合并濾液，將所得濾液經旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮后，采用真空干燥箱干燥，再將干品用蒸餾水溶解，備用。

1.3.2 標準曲線的制作

[16]，蘆丁標準品10 mg，用70%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，搖勻，得到質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，通過紫外分光光度計在509 nm波長處測定上述樣品的吸光度，以各樣品中蘆丁質量濃度（ρ，mg/mL）為橫坐標，以蘆丁標準溶液吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。經線性回歸的回歸方程和相關系數為: ρ = 12.393A-0.031 3，R2= 0.999 2。

1.3.3 山杏核殼提取液總黃酮質量濃度測定

取1 mL山杏核殼提取液于25 mL容量瓶中，以制備標準曲線的方法，即亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法顯色，采用紫外分光光度計在509 nm波長處測定吸光度，并利用回歸方程計算提取液中總黃酮質量濃度，并按公式(1)計算山杏核殼提取液總黃酮含量。

式中:ρ為提取液中總黃酮質量濃度/（mg/mL）；n為提取液的稀釋倍數。

1.3.4 大孔樹脂的預處理

按參考文獻[17-18]，將D101、HPD400、D001、AB-8 4 種大孔樹脂用無水乙醇進行洗滌，并不斷攪拌，以除去氣泡，靜置24 h，充分溶脹。以乙醇濕法裝柱，用93%乙醇溶液在柱上流動淋洗，后用蒸餾水沖洗樹脂至無醇味。再分用2% NaOH溶液和5%鹽酸溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，備用。

1.3.5 大孔樹脂的篩選

按參考文獻[19-22]，通過靜態吸附與解吸及靜態吸附動力學實驗，對大孔樹脂進行篩選。

1.3.5.1 不同大孔樹脂對山杏核殼黃酮的靜態吸附與解吸

精密稱取4 種預處理過的大孔樹脂1.5 g分別置于50 mL錐形瓶中，準確加入已知黃酮質量濃度樣品溶液30 mL，于30 ℃恒溫水浴振蕩2 h，取出后靜置24 h，使4 種大孔樹脂達到飽和吸附，吸取上層清液測定黃酮質量濃度。充分洗滌后過濾得到上述達到飽和吸附的4 種大孔樹脂，分別加入95%乙醇溶液30 mL進行解吸，每隔10 min振蕩20 s，持續2 h，吸取上層清液測定黃酮質量濃度，按照式（2）～（4）分別計算4種大孔樹脂對山杏核殼總黃酮的吸附量、吸附率及解吸率。

式（2）～（4）中:ρ0為上樣溶液初始黃酮質量濃度/（mg/mL）；V0上樣溶液體積/mL；ρ1為過柱液和水洗液中黃酮質量濃度/（mg/mL）；V1為過柱液和水洗液總體積/mL；ρ2為洗脫液中黃酮質量濃度/（mg/mL）；V2為洗脫液體積/mL；m為大孔樹脂質量/g。

1.3.5.2 大孔樹脂靜態吸附動力學特征

吸附動力學特征反映隨時間的延長大孔樹脂對樣品分子吸附量的變化趨勢。由于大孔樹脂的吸附動力學特征與生產率密切相關，因此取吸附和解吸效果相對較優的D101、HPD400、AB-8 3 種大孔樹脂進行動力學特性測定。精密稱取3 種大孔樹脂2 g，置于50 mL錐形瓶中，準確加入已知總黃酮質量濃度的樣品溶液30 mL，于30 ℃恒溫水浴振蕩吸附，后靜置24 h，使其達到飽和吸附，期間每隔一定時間吸取上層清液測定總黃酮質量濃度，計算其吸附量，以大孔樹脂的吸附量為縱坐標，時間為橫坐標，繪制3 種大孔樹脂靜態吸附動力學曲線。

1.3.6 大孔樹脂動態吸附單因素試驗及正交試驗

按參考文獻[23-25]，以上樣溶液質量濃度、pH值、流速3 個因素為研究對象，以大孔樹脂對山杏核殼黃酮類化合物的吸附率為指標，進行單因素試驗，并通過正交試驗選取最優條件。通過公式（5）計算大孔樹脂動態吸附率:

式中:ρ0為上樣溶液黃酮質量濃度/（mg/mL）；V0上樣溶液體積/mL；ρ1為過柱液和水洗液中黃酮質量濃度/（mg/mL）；V1為過柱液和水洗液總體積/mL。

1.3.7 樣品中總黃酮含量的計算

準確稱取一定質量干樣品，用溶劑溶解成樣品溶液，利用紫外分光光度計測其吸光度，并通過1.3.2節中回歸方程得到總黃酮質量濃度，通過公式（6）計算樣品質量分數計算:

式中:ρ為分光光度計測定樣品的總黃酮質量濃度/（mg/mL）；n為樣品溶液稀釋倍數；V為樣品溶液體積/mL；m為干樣品質量/mg。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的選擇

取一定量D101、AB-8、HPD400、D001 4 種大孔樹脂，按1.3.5節方法進行靜態吸附和解吸實驗，考察4 種大孔樹脂對總黃酮的吸附與解吸性能，結果如表1所示。

從表1可以看出，D101、AB-8、HPD400 3 種大孔樹脂對樣品吸附量和吸附率均較高，說明這3 種大孔樹脂對樣品有較好的吸附作用，均適合用來純化樣品，而D001大孔樹脂對樣品吸附量和吸附率均非常低，說明其對樣品吸附作用不好，不適合用來純化樣品，因此只選取D101、AB-8、HPD400 3 種大孔樹脂進行靜態吸附動力學實驗。

如圖1所示，3 種大孔樹脂對山杏核殼黃酮類物質的吸附均為快速平衡型，靜態吸附2 h后基本達到吸附平衡，之后無明顯變化。綜合比較靜態吸附、解吸實驗與靜態吸附動力學實驗結果，D101大孔樹脂對山杏核殼總黃酮吸附率和解吸率均比其他樹脂高，且具有良好的靜態吸附動力學特征，因此最終選取D101大孔樹脂對山杏核殼總黃酮進行純化，并進行動態吸附的研究。

2.2 動態吸附實驗結果

大孔樹脂實際純化過程是一個動態過程，因此不能完全通過靜態吸附、解吸過程來直接分析大孔樹脂對樣品的吸附、解吸能力和結果，有必要進行動態吸附、解吸實驗。對通過上述實驗篩選出來的D101大孔樹脂進行濕法裝柱，柱床體積為20 mL，分別就影響吸附、解吸的各個因素進行動態實驗，并分析實驗結果，選擇最優純化工藝。

2.2.1 上樣溶液質量濃度的選擇

為了考察上樣溶液質量濃度對動態吸附的影響，分別配制黃酮質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的上樣溶液，各取50 mL，在pH 5的條件下上樣，控制流速為3 mL/min，結果見圖2。結果表明，隨著上樣溶液質量濃度的增大，D101大孔樹脂對山杏核殼總黃酮的動態吸附率逐漸上升，當質量濃度達到0.3 mg/mL時，吸附率最大，隨后吸附率下降，這可能是由于上樣溶液質量濃度過大，雜質過多造成層析柱濾膜及大孔樹脂表面的堵塞，從而影響吸附效果。因此，選擇上樣溶液質量濃度為0.3 mg/mL。

2.2.2 上樣溶液pH值的選擇

為了考察上樣溶液pH值對動態吸附的影響，取50 mL黃酮質量濃度為0.3 mg/mL的上樣溶液，分別在pH值為1、2、3、4、5的條件下上柱，控制流速為3 mL/min，結果見圖3。結果表明，隨著上樣溶液pH值的增大，D101大孔樹脂對山杏核殼總黃酮的動態吸附率上升，在pH 2時達最大值，隨后不斷減小。這是因為大部分黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，溶質在酸性條件下溶解度降低，從而有利于大孔樹脂的吸附。當pH 1的時候吸附率又明顯下降，這可能是由于酸性過強會有沉淀析出，從而影響吸附，導致吸附率明顯下降。因此，選擇上樣溶液pH值為2。

2.2.3 上樣溶液流速的選擇

為了考察上樣溶液流速對動態吸附的影響，取50 mL黃酮質量濃度為0.3 mg/mL的上樣溶液，在pH 2的條件下上柱，控制流速分別為1、2、3、4、5 mL/min，結果見圖4。結果表明，隨著上樣溶液流速的增大，D101大孔樹脂對山杏核殼總黃酮的動態吸附率逐漸下降，這是因為上樣溶液的流速越小與大孔樹脂接觸就更充分，能夠充分地被吸附在其表面，而流速越大，其泄漏量就隨之增大，從而影響吸附率。在上樣溶液流速分別為1 mL/min和2 mL/min時，大孔樹脂對樣品中總黃酮的吸附率相差很小，但過柱速度卻相差一倍，因此，綜合考慮吸附率與過柱速度，選擇上樣溶液流速為2 mL/min。

2.2.4 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，選取上樣溶液質量濃度0.3 mg/mL、pH 2、流速2 mL/min 3 個因素，設計正交試驗因素水平，設計正交試驗表，并進行方差分析。正交試驗設計及結果見表2。

根據表2試驗數據，進行顯著性檢驗，列出方差分析表，結果見表3。

表2直觀分析和表3方差分析結果表明，影響D101大孔樹脂對山杏核殼總黃酮吸附能力的各個因素影響力大小為B＞A＞C，上樣液的pH值對吸附效果影響顯著（P＜0.05），上樣液的質量濃度和流速對吸附效果影響不顯著。結果顯示，D101大孔樹脂吸附山杏核殼總黃酮的最優工藝條件為A2B2C2，即上樣液黃酮質量濃度0.3 mg/mL、pH 2、控制流速2 mL/min。

2.2.5 最優吸附工藝的驗證

正交試驗優化得到D101大孔樹脂吸附山杏核殼總黃酮的最優工藝條件A2B2C2，在上述實驗條件下進行組合驗證實驗，平行實驗3 次取平均值，得到總黃酮吸附率平均值為75.20%，大于或等于正交試驗中各條件下的結果，相對標準偏差為2.55%，該工藝條件可靠。

2.3 大孔樹脂重復利用檢驗

一般情況大孔樹脂在多次使用后，由于不可逆吸附了一些雜質而導致吸附能力降低，圖5為D101大孔樹脂重復多次使用后的吸附能力檢驗情況。

圖5結果表明，大孔吸附樹脂在經過7 次重復使用后，吸附能力稍有降低，但變化并不明顯，運用SPSS分析，通過方差齊性檢驗和方差分析得到，隨著吸附次數的增加，吸附率變化不顯著，說明D101大孔樹脂適合該工藝下的山杏核殼總黃酮的重復純化。

2.4 純化前后樣品總黃酮含量對比

分別準確稱取一定量純化前與純化后干品，用60%乙醇溶液溶解，利用紫外分光光度計分別測其總黃酮含量，結果顯示，純化前樣品中山杏核殼總黃酮質量分數為36.20%，經大孔樹脂純化后的樣品中山杏核殼總黃酮質量分數為51.63%。說明上述純化工藝效果明顯，具有實際應用性。

3 結 論

本實驗采用大孔樹脂對山杏核殼提取物中的總黃酮進行純化。通過靜態吸附、解吸以及動力學特征分析，選擇D101大孔樹脂作為理想樹脂，對山杏核殼總黃酮進行純化。通過動態吸附，得到最優純化工藝條件為:上樣液質量濃度0.3 mg/mL、pH 2、控制流速2 mL/min。在此條件下，大孔樹脂對山杏核殼總黃酮的平均吸附率為75.20%。

經驗證實驗表明，本純化工藝穩定可靠，此條件下大孔樹脂純化后的山杏核殼總黃酮質量分數為51.63%，相比于純化前質量分數36.20%有較大提高，說明用D101大孔樹脂對純化山杏核殼總黃酮的方法是可行且有效的。D101大孔樹脂經過多次重復吸附，效果依然良好，重復利用性好，適合工業化生產。

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Purification of Total Flavonoids from Shells of Wild Apricot with Macroreticular Resin

YANG Zhe, WAN Shan, ZHANG Qiaohui, NING Yaping, DONG Shibin, WANG Jianzhong*
(Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

The purification of total flavonoids extracted from the shells of wild apricot using D101 macroreticular resin was optimized using combination of single factor and orthogonal array experiments. The results showed that the optimum purification conditions were determined as follows: sample concentration, 0.3 mg/mL; pH 2; flow rate for elution, 2 mL/min. With these parameters, the purity of total flavonoids was 51.63%. Therefore, D101 macroreticular resin was effective in purifying total flavonoids from the shells of wild apricot with good stability and repetition.

shells of wild apricot; total flavonoids; macroreticular resin; purification

TS201.1

A

10.7506/spkx1002-6630-201510008

2014-10-14

林業公益性行業科研專項(201004081)

楊喆(1990—),男,碩士研究生,研究方向為天然產物提取。E-mail：yangz0719@163.com

*通信作者：王建中(1951—),男,教授,碩士,研究方向為林產品加工利用。E-mail：w62338221@163.com