響應面法優化草魚內臟蛋白質酶解工藝

叢艷君，于曉鳳，陳 澍

(1.北京工商大學食品學院,北京 100048；2.北京工商大學 北京市食品風味化學重點實驗室,北京 100048；3.北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

響應面法優化草魚內臟蛋白質酶解工藝

叢艷君1,2，于曉鳳1,2，陳 澍1,3

(1.北京工商大學食品學院,北京 100048；2.北京工商大學 北京市食品風味化學重點實驗室,北京 100048；3.北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

為實現草魚內臟蛋白質的高值化利用，本研究在單因素試驗基礎上應用響應面試驗優化了木瓜蛋白酶水解脫脂草魚內臟蛋白質的條件，響應面法分析得出4 個影響因素的最佳組合為加酶量33 015 U/g、酶解溫度62.35 ℃、酶解時間5.37 h、酶解pH 7.9，此時水解度為44.48%，肽得率為19.68%，水解液鮮味較明顯。

草魚內臟；蛋白質；水解；響應面試驗；優化

我國淡水魚養殖業雖然發達，但是水產品加工率不到10%[1-2]，在魚加工制品的廢棄物中，蛋白質、脂肪和酶類含量較高的內臟的加工尤其未得到重視[3-5]，這不僅造成了資源的浪費，而且污染環境，給環境帶來巨大負擔[6]。草魚是四大家魚之一，草魚內臟蛋白質中必需氨基酸的含量占總氨基酸含量的41.56%左右，除了硫氨酸的含量較低外，其他氨基酸的含量均接近或超過全蛋蛋白，尤其以賴氨酸的含量最高為7.6%[7]。

利用酶水解技術加工魚內臟和提取活性成分[8-9]，可減少資源浪費和環境污染[10]、提高魚內臟的質量、改善其營養價值和提升魚內臟的加工利用率，同時滿足市場對高附加值魚類制品的需求，具有重要的經濟和社會意義。國內在應用微生物發酵制備傳統調味品如醬油、魚露等方面工藝成熟[11]，而應用生物技術（主要是酶技術）深加工農產品起步晚，基礎和應用基礎薄弱[12-13]。目前各種動植物原料的生物技術應用主要集中在采用各種特異性酶探索作用效果、蛋白質水解產物加工功能特性研究方面，對各種呈味肽的分離純化以及功效研究尚處于初步階段，市場上國產的呈味肽產品寥寥無幾[14-16]。本課題組前期研究了木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解草魚內臟蛋白質的特性，發現6 種酶解液中氨基酸和多肽含量較豐富，感官評價結果表明，使用風味蛋白酶的水解液鮮味最強，其次為木瓜蛋白酶，這為實現草魚內臟的高值化利用提供了思路[17]。基于前期基礎，本課題應用響應面試驗優化木瓜蛋白酶水解脫脂草魚內臟蛋白質的條件，以期為后續的應用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 北京市四道口水產品批發市場。

木瓜蛋白酶（酶活力4 982 U/g） 美國Sigma公司；乙醚、濃硫酸、鹽酸、硼酸、硫酸鉀、溴甲酚綠、甲基紅 北京化學試劑公司；氫氧化鈉 西隴化工股份有限公司；甲醛 天津市永大化學試劑公司；硫酸銅 天津市光復科技發展有限公司。實驗所用試劑均為化學純。

1.2 儀器與設備

DKB-501A超級恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；PHS-3D功能型pH計 上海三信儀表廠；TB214型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；CR22G型離心機 日本Hitachi公司；Kejeltic 2100型凱氏定氮儀 瑞士Foss公司；D2004W電動攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；Spectrumlab 22pc可見分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂草魚內臟蛋白質酶解液的制備

將去除膽囊和魚鰾的草魚內臟清洗，絞碎，置于95 ℃水浴鍋中20 min，滅內源酶活。冷卻后按1∶1（g/mL）加入去離子水，在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心10 min，去除上層液體，收集下層沉淀。重復上述操作，即得到粗脫脂草魚內臟蛋白質，凍干備用。

1.3.2 酶解單因素試驗

以脫脂草魚內臟蛋白質為底物恒溫水浴酶解，控制加酶量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值，酶解結束時將酶解液在95 ℃水浴中滅酶15 min。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，結合單因素試驗結果，對4 個因素加酶量（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時間（X3）、酶解pH值（X4）在-1、0、1這3 個水平上進行優化。試驗因素與水平設計見表1。

1.3.4 水解度的測定

以甲醛電位滴定法[18]測定氨基酸態氮含量；水解度計算如式（1）所示。

1.3.5 肽得率的測定

1.3.6 酶解液的脫色脫腥處理

酶解液在pH 4.0、溫度50 ℃、粉狀活性炭用量0.5%條件下水浴振蕩40 min進行脫色脫腥，離心，取上清液進行感官評價。

1.3.7 感官評價

感官評價采用排序檢驗法測定[19-21]。10 mmol/L谷氨酸鈉作為對照樣品,鮮味標準是“中”,并通過水浴加熱保持對照、樣品溫度在40 ℃左右。評定小組包含12 名感官評價員(6 男6 女,23～50 歲),評定小組人員均受過相關培訓,能夠嘗出標準品的鮮味,將酶解液作為品嘗對象,比較待測樣品與對照樣品中鮮味感差別,評價其鮮味。酶解液放入口中15 s吐出,每個樣品給兩次,打分采用五分制,取平均值。評定前用清水漱口,評定時拒絕交流,且樣品需用帶中性的文字標明,避免主觀評價。

1.4 數據分析

采用Design-Expert 8.0.5軟件，進行響應面試驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 加酶量的確定

取凍干脫脂草魚內臟蛋白質，按底物質量分數3%加入水，調酶解pH 7.5，分別按20 000、25 000、30 000、35 000、40 000 U/g加入木瓜蛋白酶，在60 ℃條件恒溫振蕩酶解6 h，95 ℃終止酶反應，常溫取樣測定其水解度和肽得率。

由圖1可知，水解度隨著加酶量的增加升高速率較為緩慢，差異不顯著（P＞0.05），這主要是由于隨著加酶量的增加，酶已逐漸被底物所飽和，酶促反應速率趨向最大值。肽得率在加酶量為30 000 U/g達到最大值20.99%，隨后有下降的趨勢，原因在于酶量的增加使得酶與底物的接觸更加充分，底物被進一步酶解為小分子肽和游離氨基酸，不同加酶量條件下肽得率差異顯著（P＜0.05）。綜合考慮，30 000 U/g的加酶量水解程度和肽得率都較佳。

2.2 酶解溫度的確定

取凍干脫脂草魚內臟蛋白質，按底物質量分數3%加入水，調酶解pH 7.5，按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶，分別在50、55、60、65、70 ℃條件下，恒溫振蕩酶解6 h，95 ℃終止酶反應，常溫取樣測定其水解度和肽得率。

由圖2可知，酶解溫度50～60 ℃，水解度和肽得率都不斷升高，但超過60 ℃之后，水解度和肽得率明顯下降，不同酶解溫度條件下水解度和肽得率差異均顯著（P＜0.05）。溫度是影響酶促反應的一個重要因素，隨著溫度的升高會加快酶促反應，但是當溫度超過了酶的最適反應溫度時會降低反應的速率，木瓜蛋白酶的最適反應溫度是60 ℃。

2.3 酶解時間的確定

取凍干脫脂草魚內臟蛋白質，按底物質量分數3%加入水，調酶解pH 7.5，按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶，分別恒溫振蕩酶解4、5、6、7、8 h終止酶反應，常溫取樣測定其水解度和肽得率。

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，水解度不斷的提高，酶解5 h的效果較酶解4 h的有明顯的提高，5 h之后水解度的增加比較緩慢。而肽得率在酶解5 h時達到最大值23.19%，而后有明顯的下降趨勢，7～8 h下降趨于平緩，不同時間水解度和肽得率差異均顯著（P＜0.05），因此確定最適酶解時間為5 h。

2.4 酶解pH值的確定

取凍干脫脂草魚內臟蛋白質，按底物質量分數3%加入水，分別調酶解pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，按30 000 U/g加入木瓜蛋白酶，在60 ℃條件恒溫振蕩酶解6 h，95 ℃終止酶反應，常溫取樣測定其水解度和肽得率。

由圖4可知，當pH值小于7.5時，水解度與肽得率較低，pH 7.5時水解度和肽得率均達到最大值，分別是41.86%和20.99%，當pH值達到7.5以后水解度與肽得率不再增加，開始逐漸降低，不同pH值條件下水解度、肽得率差異均顯著（P＜0.05）。因此木瓜蛋白酶反應的最適pH 7.5。

2.5 響應面分析法優化草魚內臟蛋白質的水解條件

以加酶量(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)、酶解pH值(X4)為自變量,以水解度、肽得率為響應值,響應面試驗方案及結果見表3。

2.5.1 水解度為響應值的響應面試驗優化

方差分析和酶解各因素的顯著性比較結果見表4 。

利用Design-Expert軟件對所得數據進行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為:

用上述回歸方程描述各因素與水解度之間的關系時，其因素和全體自變量之間的線性關系顯著（R2=0.814 6），模型達極顯著水平（P＜0.01）。模型中X1、X32、X1X3對水解度的影響極顯著，X2、X3、X4對水解度的影響顯著。而失擬項P=0.103 9＞0.05，不顯著，說明方程對試驗擬合較好，因此用此方程模型來模擬四因素與響應值的關系是可行的。

圖5顯示了6 組試驗參數以水解度為響應值的趨勢圖。由圖5B、5D、5F的等高線圖可以看出，酶解時間與加酶量、酶解溫度、酶解pH值的交互作用顯著。只有在加酶量、酶解溫度、酶解時間和酶解pH值適宜的情況下，脫脂草魚內臟的水解度才會達到最大值。

2.5.2 肽得率為響應值的響應面試驗優化

方差分析和酶解各因素的顯著性比較結果見表5。

利用Design-Expert軟件對所得數據進行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為:

用上述回歸方程描述各因素與肽得率之間的關系時，其因素和全體自變量之間的線性關系顯著（R2=0.919 8），模型達極顯著水平（P＜0.01）。模型中X1、X3、、、、、X1X3、X3X4對肽得率的影響極顯著，X2、X4、X1X2對肽得率的影響顯著。而失擬項P=0.261 6＞0.05，不顯著，說明方程對試驗擬合較好，因此用此方程模型來模擬四因素與響應值的關系是可行的。

圖6中各圖分別顯示了6組試驗參數以肽得率為響應值的趨勢圖。由圖6B、D、F的等高線圖可以看出，酶解時間與加酶量、酶解溫度、酶解pH值的交互作用顯著。只有在加酶量、酶解溫度、酶解時間和酶解pH值都適宜的情況下，脫脂草魚內臟的肽得率才會達到最大值。

2.5.3 響應面優化結果及驗證

經響應面法分析得出4 個影響因素的最佳組合為加酶量33 015 U/g、酶解溫度62.35 ℃、酶解時間5.37 h、酶解pH 7.9，此時的水解度達到44.65%，肽得率為18.49%，感官評分為2.16。為了檢驗模型預測的準確性，在最佳酶解條件下進行實驗，實際測得的水解度為44.48%，肽得率為19.68%，感官評分為2，即總體風味柔和，鮮味強度適中。可見該模型能較好的預測草魚內臟蛋白質的酶解情況。

3 討論與結論

近年來，我國食品工業面臨著來自資源和環境的雙重壓力，對現有蛋白質資源，特別是對大宗低值蛋白資源的精深加工，是解決長期以來嚴重制約我國食品工業發展問題的必要途徑。國內關于低值魚加工副產物綜合利用的研究不斷增多，也相應取得了較為突出的進展，但綜合利用整體水平并未顯著提高，未能在大范圍深層次內實現高值化綜合利用。魚腥味的殘留已經成為阻礙低值魚加工副產物產業化發展的重要因素，因此未來的研究應進一步的完善，以解決這些問題為目的[22]。喬路等[23]研究了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制備鮑魚臟器呈味肽及呈味氨基酸的最佳條件，中性蛋白酶酶解產物的水解度和肽得率最大，鮮味氨基酸含量最高且口味最好。Benjakul等[2]利用堿性蛋白酶酶解太平洋白魚下腳料得到了高含量的蛋白質（79.97%）。余杰等[24]酶解鰻魚下腳料得到的蛋白提取物具有營養價值高、海鮮風味濃郁的特點。Bhaskar等[5]對印度一種淡水魚Catla魚內臟蛋白質用中性蛋白酶進行酶解，找到了酶解的最佳條件，在自然pH值、料液比1.25% （g/mL）、溫度55 ℃、水解時間165 min條件下，水解度大于48%。Bhaskar等[25]對Catla魚內臟蛋白質用堿性蛋白酶進行酶解得到了酶解的最佳條件即pH 8.5、料液比1.5%（g/mL）、溫度50 ℃、水解時間135 min時水解度接近50%。何莉萍等[26]在草魚內臟資源的綜合利用技術研究中發現水解溫度、時間、pH值、加酶量是影響草魚內臟蛋白水解的關鍵因素，通過實驗分析，可得到高的蛋白質溶出率。本研究探索了木瓜蛋白酶酶解草魚內臟蛋白質的特性，以脫脂草魚內臟蛋白為底物，以感官評分為指標，通過響應面試驗確定加酶量33 015 U/g、酶解溫度62.35 ℃、酶解時間5.37 h、酶解pH 7.9為最佳反應條件，本研究通過酶解的技術使鮮味多肽與鮮味氨基酸更多的釋放，并且利用活性炭對水解液進行了脫腥處理，提高了草魚內臟蛋白質的滋味品質，此時水解物水解度為44.48%，肽得率為19.68%，感官評分為2。

酶水解技術在魚內臟加工的應用將越來越廣泛，但是仍然存在一些問題，如酶解產物的不確定性及后期分離純化的復雜性，過度酶解時產品有苦味，如何更加有效脫除苦腥味提高其可食性等將是魚內臟深加工技術未來研究的重點內容。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions of Grass Carp Visceral Proteins by Response Surface Methodology

CONG Yanjun1,2, YU Xiaofeng1,2, CHEN Shu1,3
(1. College of Food Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Key Laboratory for Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 3. Beijing Higher Institution Engineering Research Center for Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The hydrolysis conditions of defatted visceral waste proteins of grass carp with papain were optimized by the combined use of single factor method and response surface methodology. An enzyme dosage of 33 015 U/g, a hydrolysis temperature of 62.35 ℃, a hydrolysis time of 5.37 h and initial pH 7.9 were found to be optimal for the hydrolysis of visceral proteins of grass carp. Under these conditions, the degree of hydrolysis (DH) was 44.48% with a peptide yield of 19.68%, and the hydrolysate had a medium umami taste.

grass carp viscera; protein; hydrolysis; response surface methodology; optimization

S254.9

A

10.7506/spkx1002-6630-201510009

2014-10-19

北京市自然科學基金項目(6132004)；北京市科技新星計劃項目(Z131102000413005)

叢艷君(1978—),女,副教授,博士,研究方向為食品蛋白質化學與工程。E-mail：cyj_win@sina.com