正交試驗(yàn)優(yōu)化靈芝三萜白蛋白納米體制備工藝及其分子表征

黃 婷,范遠(yuǎn)景,*,孟 靜,張 帆,耿保玉,劉培志,王明和

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009；2.安徽劉郎食品有限公司,安徽 宣城 242000)

正交試驗(yàn)優(yōu)化靈芝三萜白蛋白納米體制備工藝及其分子表征

黃 婷1,范遠(yuǎn)景1,*,孟 靜1,張 帆1,耿保玉1,劉培志2,王明和2

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009；2.安徽劉郎食品有限公司,安徽 宣城 242000)

研究用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為載體包裹靈芝三萜制備納米體的工藝與其分子表征；采用去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法制備靈芝三萜白蛋白納米體，以白蛋白納米體包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化靈芝三萜白蛋白納米體的配方。結(jié)果表明:將BSA 50 mg溶于5 mL去離子水中，取靈芝三萜8 mg溶于25 mL無(wú)水乙醇中，水相以400 r/min持續(xù)攪拌的同時(shí)以1 mL/min的速率滴加靈芝三萜乙醇溶液，加入0.25%的戊二醛溶液125 ?L，室溫條件下固化12 h，減壓濃縮除去乙醇，得到的靈芝三萜白蛋白納米體粒徑為（189±11.13）nm，多分散指數(shù)為0.227±0.016，Zeta電位為（-31.4±6.74）mV，包封率為（80.10±1.05）%，載藥量為（11.36±0.13）%，納米體溶液于4 ℃放置30 d，穩(wěn)定性良好。

靈芝三萜；牛血清白蛋白；納米體；穩(wěn)定性

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種食藥兼用的真菌，被譽(yù)為“不朽的蘑菇”，其主要的兩大活性成分是三萜和多糖[1-3]。靈芝三萜類(lèi)化合物具有廣泛的生理活性和藥理作用，如:降血脂、降血糖、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝護(hù)肝、提高免疫力、抗衰老、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、毒殺腫瘤細(xì)胞等[4-11]。但靈芝三萜難溶于水，能溶于氯仿、乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑，文獻(xiàn)[12]報(bào)道靈芝三萜生物利用度低，特別是酸性三萜入血較快，口服靈芝酸A（50 mg/kg），18 min血藥濃度就達(dá)到最高峰[13]。為了增強(qiáng)靈芝三萜的溶解度及改善吸收，提高生物利用度，可將靈芝三萜制成白蛋白載藥微粒。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是生命體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，較容易得到純度高的BSA蛋白樣品，白蛋白分子中的氨基酸相互扭曲成團(tuán)狀或蜂窩狀，具有大量的空隙，空間結(jié)構(gòu)有利于攜帶藥物[14]。BSA可以通過(guò)物理或化學(xué)手段與藥物結(jié)合，起到重要的貯存和運(yùn)輸?shù)淖饔?，并能使藥物在體內(nèi)緩慢釋放[15-18]。用白蛋白納米體包封研究的藥物主要有阿霉素、紫杉醇等。紫杉醇白蛋白納米粒的問(wèn)世避免了以往紫杉醇注射劑因溶解問(wèn)題帶來(lái)的一系列副作用，并大大提高了紫杉醇的溶解性。多項(xiàng)研究已證實(shí)，其在多種腫瘤的治療中取得突破性進(jìn)展[19-20]。本研究采用去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法制備靈芝三萜白蛋白納米體，優(yōu)化其制備工藝，并初步研究了其理化性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白 上海源聚生物科技有限公司；靈芝三萜（純度80%） 鄭州荔諾生物科技有限公司；香草醛、無(wú)水乙醇、戊二醛、高氯酸、冰醋酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

78-1型加熱磁力攪拌器 杭州儀表及電廠；JEM-2100場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡 日本電子制造公司；Nano-ZS90 Zeta電位儀 英國(guó)Malvern公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海勝申生物技術(shù)有限公司；TGC-16C臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 靈芝三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取靈芝三萜標(biāo)準(zhǔn)樣品5 mg，置于25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至刻度。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于試管中，在100 ℃水浴上蒸干。然后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL和高氯酸1.6 mL，迅速混合均勻。再將試管置于70 ℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中，冷卻至室溫后，加入8 mL冰醋酸搖勻置于室溫。15 min后用分光光度計(jì)在545 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定其吸光度。以靈芝三萜質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 靈芝三萜白蛋白納米體的制備

取一定量的BSA溶于去離子水中，使其充分溶解。再取處方量靈芝三萜溶于一定量的無(wú)水乙醇中。水相以400 r/min持續(xù)攪拌的同時(shí)以1 mL/min的速率滴加靈芝三萜乙醇溶液，至乳白色膠狀液形成。滴加結(jié)束以后迅速滴入一定量的0.25%戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌固化12 h。在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，剩余膠狀液12 000 r/min冷凍離心20 min。除去上清液，沉淀部分用去離子水復(fù)溶，并定容至10 mL，即得到負(fù)載靈芝三萜的白蛋白納米體混懸液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

白蛋白納米體的評(píng)價(jià)指標(biāo)有很多，如載藥量、包封率、粒徑分布、理化穩(wěn)定性等[21]，其中包封率是衡量白蛋白納米體的重要指標(biāo)，故以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行處方篩選。以靈芝三萜白蛋白納米體的制備方法為基礎(chǔ)，采用單因素試驗(yàn)系統(tǒng)考察BSA質(zhì)量（30、40、50、60 mg）、無(wú)水乙醇體積（10、15、20、25 mL）、靈芝三萜質(zhì)量（4、8、10、12 mg）、0.25%戊二醛溶液體積（100、125、150、175 ?L）這4 個(gè)因素對(duì)白蛋白納米體包封率的影響。試驗(yàn)中考察主要因素時(shí)其余因素全部選擇水平3。

1.3.4 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化靈芝三萜白蛋白納米體配方

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，擬定了L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

1.3.5 靈芝三萜白蛋白納米體包封率和載藥量的測(cè)定

取攪拌均勻的納米體混懸液分裝到離心管中，12 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL置于試管中，在100 ℃水浴上蒸干。然后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL和高氯酸1.6 mL，迅速混合均勻。再將試管置于70 ℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中，冷卻至室溫后，加入8 mL冰醋酸搖勻置于室溫。以空白白蛋白納米體作為對(duì)照組，15 min后用分光光度計(jì)在545 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算其所對(duì)應(yīng)的靈芝三萜質(zhì)量作為M游。按式（1）、（2）計(jì)算包封率和載藥量。

式中:M總為總的靈芝三萜加入量/mg；M游為未被包裹的靈芝三萜質(zhì)量/mg；MBSA為BSA的加入量/mg。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

分別取干燥的靈芝三萜、空白白蛋白納米體、靈芝三萜白蛋白納米體和空白白蛋白納米體與靈芝三萜混合物各2.0 mg，加入100～200 mg溴化鉀晶體，用石英研缽研細(xì)，將粉末裝入模具內(nèi)，用壓片機(jī)壓制成片，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描得到FT-IR分析。

1.3.7 靈芝三萜白蛋白納米粒的形態(tài)、Zeta電位、粒徑及粒徑分布測(cè)定

1.3.7.1 透射電子顯微鏡觀察納米體的形態(tài)

取靈芝三萜白蛋白納米體混懸液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，取一滴滴在銅網(wǎng)上，自然揮干，干燥后用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片。

1.3.7.2 納米體電勢(shì)和粒徑測(cè)定

取靈芝三萜白蛋白納米體混懸液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，用Zeta電位儀測(cè)定納米體電位、粒徑及粒徑分布。

1.3.8 靈芝三萜白蛋白納米體穩(wěn)定性初步考察

將制備好的納米體分裝到小瓶?jī)?nèi)，密封，置于冰箱中（4 ℃）。分別于0、10、20、30 d取樣，用Zeta電位儀測(cè)樣品粒徑和多分散指數(shù)，用測(cè)包封率的方法測(cè)游離靈芝三萜的量 ，并計(jì)算貯存過(guò)程中的滲透率。如式（3）所示。

式中:M0為制備剛完成時(shí)游離靈芝三萜的量/mg；M包封為制備剛完成時(shí)被包封靈芝三萜的量/mg；Mn為儲(chǔ)存n d后游離靈芝三萜的量/mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按1.3.1節(jié)的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)靈芝三萜的含量（mg）和吸光度的關(guān)系，建立線性回歸方程: Y= 3.308 6X-0.002 6，R2為0.999 5，表明靈芝三萜在0～0.12 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定其他條件，改變BSA質(zhì)量、無(wú)水乙醇體積、靈芝三萜質(zhì)量、0.25%戊二醛溶液體積，考察其對(duì)白蛋白納米體包封率的影響。

由圖1可見(jiàn)，隨著B(niǎo)SA質(zhì)量的增大，包封率先增大后減小。由此可見(jiàn)在一定范圍內(nèi)增大BSA的用量可使包封的靈芝三萜量隨之增大，但是由于交聯(lián)劑戊二醛的體積一定，所以當(dāng)BSA的用量增加到50 mg以上時(shí)，它不能很好的交聯(lián)成球，故使包封率下降。

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)靈芝三萜質(zhì)量和水的體積一定時(shí)，隨著無(wú)水乙醇體積增大，包封率先增大而后又減小。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，靈芝三萜質(zhì)量濃度越小包封效果越好，之后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)可能是受乙醇和水比例的影響。

由圖3可見(jiàn)，隨著靈芝三萜加入量的增加，包封率也隨之增加，但當(dāng)靈芝三萜的加入量增至10 mg，再增加加入量時(shí)包封率出現(xiàn)下降，這是由于納米體對(duì)芯材物質(zhì)的包埋有飽和性，并非芯材物質(zhì)的加入量越多包封率越大。

由圖4可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)戊二醛的使用量增加可使包封率有所增加。戊二醛用量增加使納米體的內(nèi)部交聯(lián)度增高，交聯(lián)速率加快，從而抑制了藥物向油相的擴(kuò)散，使藥物包封率增加。與其他因素相比較，戊二醛的使用量對(duì)白蛋白納米體包封率的影響較小。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表2可見(jiàn)，在本實(shí)驗(yàn)所選用的因素和水平條件下，最優(yōu)組合條件為A3B3C1D2，各因素對(duì)包封率影響的程度為A＞C＞B＞D。即BSA的質(zhì)量為50 mg溶于5 mL水中，靈芝三萜的加入量8 mg、無(wú)水乙醇的體積25 mL、0.25%戊二醛溶液加入體積125 ?L。可以看出，最優(yōu)組合在9 次試驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn)，其中9 次試驗(yàn)中8號(hào)A3B2C1D3所制備的納米體的包封率最高。將組合A3B3C1D2和A3B2C1D3同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果按組合方案A3B3C1D2制備的納米體包封率為（80.10±1.05）%，載藥量為（11.36±0.13）%。所以A3B3C1D2為最優(yōu)組合方案。

2.4 FT-IR分析

FT-IR可以高效快速地測(cè)定被分析物中分子的吸收光譜，不同的物質(zhì)有不同的特征吸收峰，可表征其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成[22]。從圖5可看出，3 360 cm-1是靈芝三萜中O—H伸縮振動(dòng)吸收峰，2 930 cm-1為飽和C—H伸縮振動(dòng)，1 630 cm-1是靈芝三萜的α、β不飽和酮的特征吸收峰，1 410 cm-1為—CH2—的變角振動(dòng)，1 030 cm-1為C—O伸縮振動(dòng)。從譜圖中可以看出，靈芝三萜在1 030 cm-1有明顯的C—O峰，而空白白蛋白納米體在1 030 cm-1處無(wú)此峰，空白白蛋白納米體在1 240 cm-1處有C—N峰，靈芝三萜白蛋白納米體的紅外圖譜中均出現(xiàn)靈芝三萜和空白白蛋白納米體的特征峰，說(shuō)明白蛋白納米體中有靈芝三萜；靈芝三萜白蛋白納米體在1 240 cm-1處有明顯的C—N峰，而靈芝三萜與空白白蛋白納米體的混合物在此處峰不明顯，由此推斷靈芝三萜白蛋白納米體的表面主要為蛋白分子，說(shuō)明靈芝三萜被白蛋白包埋；此外，靈芝三萜在1 030 cm-1處有C—O伸縮振動(dòng)，此峰在靈芝三萜白蛋白納米體中吸收強(qiáng)度明顯弱于在混合物中的吸收強(qiáng)度，進(jìn)一步說(shuō)明靈芝三萜被白蛋白包裹成功。

2.5 白蛋白納米粒的形態(tài)、電位、粒徑及粒徑分布測(cè)定結(jié)果

由透射電鏡拍攝的照片可顯示靈芝三萜白蛋白納米粒呈現(xiàn)規(guī)整的圓球形，邊緣光滑，在水中的分散性較好，粒徑分布基本勻稱。通過(guò)單個(gè)納米粒放大圖片可以觀察到明顯的包裹結(jié)構(gòu)，結(jié)合紅外圖譜的分析可推斷納米體內(nèi)層為靈芝三萜，外殼為白蛋白球，結(jié)果見(jiàn)圖6。

多指數(shù)分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）是反映納米體系中粒徑分布范圍的指標(biāo)，PDI值越小，說(shuō)明粒徑分布范圍越窄，即體系中粒子的粒徑具有較好的規(guī)整度[23]。用Zeta電位儀測(cè)定納米體的平均粒徑是（189±11.13）nm，PDI為0.227±0.016，結(jié)果見(jiàn)圖7。實(shí)驗(yàn)制備的靈芝三萜白蛋白納米體的Zeta電勢(shì)為（-31.4±6.74）mV，與Peters[24]報(bào)道在自然狀態(tài)下BSA分子表面電勢(shì)為-18 mV相比較，BSA乳化交聯(lián)后形成的牛血清白蛋白納米體表面的電勢(shì)升高，納米體之間的靜電斥力增加，有利于阻止納米體之間的聚集。結(jié)合PDI、Zeta電勢(shì)值和電鏡拍攝的結(jié)果可初步說(shuō)明所制備的納米體混懸液穩(wěn)定性良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

靈芝三萜白蛋白納米體存放期間的物化穩(wěn)定性是其應(yīng)用的一個(gè)非常重要的方面，因?yàn)榧{米體在體內(nèi)的循環(huán)過(guò)程中為了保持芯材的活性以及達(dá)到緩釋和靶向釋放的功能必須能保證納米體球形結(jié)構(gòu)的完整性[25]。靈芝三萜白蛋白納米體混懸液在4 ℃條件下放置30 d后外觀上未見(jiàn)分層、絮凝、沉淀、變色等明顯變化。從表3可見(jiàn)，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)藥物的滲透率呈增大的趨勢(shì)，但總體滲透率較低，不超過(guò)4%，平均粒徑基本保持在200 nm左右，變化較小；PDI始終顯示較低，納米粒具有均一的分散性。由此說(shuō)明靈芝三萜白蛋白納米體在4 ℃貯存條件下能保持良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究以去溶劑化-化學(xué)交聯(lián)法成功制備了靈芝三萜白蛋白納米體，通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)制得包封率較高產(chǎn)品的同時(shí)，可以使靈芝三萜白蛋白納米體的平均粒徑不超過(guò)200 nm。放置30 d后納米體外觀、PDI、粒徑以及滲透率變化很小，具有良好的穩(wěn)定性。結(jié)果表明靈芝三萜白蛋白納米體的最佳配方為將BSA 50 mg溶于5 mL去離子水中，取靈芝三萜8 mg溶于25 mL無(wú)水乙醇中，水相以400 r/min持續(xù)攪拌的同時(shí)以1 mL/min的速率滴加靈芝三萜乙醇溶液，加入0.25%的戊二醛溶液125 ?L，室溫條件下固化12 h，減壓濃縮除去乙醇。

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Optimization of the Preparation Procedure and Molecular Characterization of Ganoderma lucidum Triterpenoids-Bovine Serum Albumin Nanoparticles by Orthogonal Array Design

HUANG Ting1, FAN Yuanjing1,*, MENG Jing1, ZHANG Fan1, GENG Baoyu1, LIU Peizhi2, WANG Minghe2
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Anhui Liu Lang Food Co. Ltd., Xuancheng 242000, China)

Purpose: To prepare and characterize Ganoderma lucidum triterpenoids-bovine serum albumin (BSA) nanoparticles. Methods: Ganoderma lucidum triterpenoids-BSA nanoparticles were prepared by desolvation-chemical crosslinking method and the preparation conditions were optimized with respect to entrapment efficiency by orthogonal array design. Results: Nanoparticles with an average particle size of (189 ± 11.13) nm, a polydispersity index (PDI) of 0.227 ± 0.016, a zeta potential of (-31.4 ± 6.74) mV, an entrapment efficiency of (80.10 ± 1.05)%, and a drug-loading efficiency of (11.36 ± 0.13)% were obtained by dropwise addition of 8 mg of Ganoderma lucidum triterpenoids dissolved in 25 mL of absolute ethanol to 50 mg/mL aqueous solution of BSA while constantly stirring the mixture at a speed of 400 r/min and subsequent prompt addition of 125 ?L of 0.25% glutaraldehyde. The nanoparticles were stable at 4 ℃ for 30 d.

Ganoderma lucidum triterpenoids; bovine serum albumin; nanoparticles; stability

TS201.4

A

10.7506/spkx1002-6630-201510010

2014-11-18

安徽省鴨肉制品工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(201306G01054)；皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院公共服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(1401032006)

黃婷(1989—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：huangtinganhui@sina.com

*通信作者：范遠(yuǎn)景(1958—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：swf89105@hfut.edu.cn