響應面優化雙水相萃取分離酵母源MT工藝

王 月，張東杰,*，王 穎,2,*，梁小月，徐炳政

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧技術工程研究中心,黑龍江 大慶 163319)

響應面優化雙水相萃取分離酵母源MT工藝

王 月1，張東杰1,*，王 穎1,2,*，梁小月1，徐炳政1

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧技術工程研究中心,黑龍江 大慶 163319)

采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-(NH4)2SO4雙水相體系，分離銅誘導的誘變釀酒酵母菌所表達的金屬硫蛋白。以PEG質量分數、(NH4)2SO4質量分數及pH值為考察因素，萃取率為響應值，結合Design-Expert 8.0.6軟件做響應面優化分析，優化到最佳萃取條件:PEG相對分子質量2 000、PEG和(NH4)2SO4質量分數分別為22.5%和17.46%、pH 5.98。獲取的金屬硫蛋白主要分布在上相，萃取率可達81.69%。此方法操作簡單、高效、成本低，是酵母源金屬硫蛋白分離提純的新方法。

金屬硫蛋白；雙水相萃取；響應面分析；分配系數；萃取率

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類分子質量低、含豐富半胱氨酸的金屬結合蛋白[1]，廣泛存在于植物、動物以及微生物體內，能被多種因素誘導產生。不同來源MT的等電點也不同，如哺乳類動物MT的pI在3.9～4.6之間，已發現的水生生物MT的pI在3.5～6.0之間。MT的分子質量較小，其范圍大致為2 000～16 000 kD，MT構象較堅固，熱穩定性強[2]。其具有清除自由基，調節鋅、銅等微量元素代謝，解除鉛、砷、汞等重金屬毒素，抗電離輻射等生物學功能，廣泛應用于食品、藥品、化妝品等領域[3-5]。

目前常用的分離純化MT方法包括層析法、DEAESepharose Fast Flow法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等[6-9]，但這些方法大多停留在實驗室階段。雙水相萃取技術作為一種新型的分離技術，具有體系含水量高、分相時間短、萃取環境溫和使蛋白質在其中不易變性、生物相容性高、易于放大和進行連續性操作等諸多優勢[10-11]，現已廣泛應用于蛋白質、多肽、核酸以及氨基酸的分離和純化[12-13]。本實驗采用聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系，通過單因素試驗及響應面優化得到雙水相萃取酵母源MT的最佳條件，為酵母源金屬硫蛋白的分離提純及工業化生產提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母N-8 實驗室誘導分離保存菌株；酵母菌MT酶聯免疫分析試劑盒 上海勁馬生物科技有限公司；YPD液體培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；FS-450N型超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；TD5A-WS臺式離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MT的誘導合成及粗提液的制備

將實驗室保存的釀酒酵母菌按2%的接菌量接至活化YPD培養基中，30 ℃、24 h搖床活化，再按2%接菌量將活化種子液接入含0.7 mmol/L CuCl2溶液的誘導YEPD培養基中，30 ℃、62 h搖床培養[14-15]。之后3 000 r/min離心25 min，去上清液收集菌體，菌體與0.01 mol/L Tris-HCl（pH 8.6）緩沖液按1∶5的體積比充分混勻，冰浴條件下超聲波破壁處理混合液，功率287 W、時間32 min。離心收集上清液，80 ℃水浴中熱變性8 min，迅速冷卻后離心收集上清液，得到MT含量約為170 ng/L的粗蛋白提取液[16]。

1.3.2 雙水相萃取酵母源MT

固定體系總質量為10.00 g，分別加入2 g聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、2 g (NH4)2SO4和1 g樣品溶液，其余質量用超純水補足，形成雙水相體系。振蕩使成相物質充分混勻，調節pH 5，靜置到兩相達到相分離，MT富集于雙水相系統的上相中，用移液管吸取上下相溶液并讀取上下相體積，求相比R；分別測定上下相MT質量濃度，計算MT的分配系數K及萃取率Y，如式（1）～（3）所示:

式中:V1為上相體積/mL；V2為下相體積/mL；ρ1為上相中MT的質量濃度/（mg/mL）；ρ2為下相中MT的質量濃度/（mg/mL）。

1.3.3 MT含量及抗氧化性測定

MT含量的測定采用酵母菌MT酶聯免疫分析法[17]，體外清除羥自由基能力的測定采用分光光度計法[18]。

1.3.4 雙水相萃取的單因素試驗

影響雙水相萃取的因素很多，本實驗重點研究了PEG的相對分子質量（600、1 000、2 000、4 000、6 000）和質量分數（5%、10%、15%、20%、25%）、(NH4)2SO4質量分數（15%、20%、25%、30%、35%）、pH值（3、4、5、6、7）、溫度（20、25、30、35、40 ℃）5個因素對酵母源MT萃取率的影響。根據20%聚乙二醇（相對分子質量2 000）、20% (NH4)2SO4、pH 6、溫度25 ℃成相條件，改變其中1 個因素，其他條件不變，分別對上述5 個因素進行單因素考察。每個單因素試驗均做3 個平行樣品，計算其平均萃取率和平均分配系數。

1.3.5 響應面優化萃取條件

Box-Behnken試驗設計是響應面分析設計試驗中利用合理的試驗設計且通過前期試驗得到一定的數據，采用多元二次方程方法來擬合響應面值及因素之間的函數關系，采用回歸方程來分析以尋求多因素系統中最優的提取條件的一種統計學方法[19-20]。根據單因素試驗的結果，在PEG的相對分子質量2 000、溫度25 ℃的條件下，選擇PEG質量分數（X1）、(NH4)2SO4質量分數（X2）、pH值（X3）3 個對酵母源MT萃取率影響較大的因素設計三因素三水平優化試驗，因素水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同相對分子質量PEG對MT萃取的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設定PEG質量分數20%、(NH4)2SO4質量分數20%、pH 6、溫度25 ℃，改變PEG相對分子質量，比較雙水相體系的MT分配系數及萃取率。

由圖1可以看出，當PEG的相對分子質量小于2 000時，隨著PEG相對分子質量的升高，MT的分配系數和萃取率均出現先升高后降低的趨勢。主要是隨PEG的相對分子質量增大，分子鏈長度增加，分子內部極性基團的羥基相對減少，疏水性增加，界面張力增大，促使MT富集于上相，MT的分配系數和萃取率隨之增加。但當PEG的相對分子質量大于2 000時，隨著PEG相對分子質量的繼續增大，黏度也隨之增大，MT在兩相間的傳遞和在相中的擴散阻力增加阻礙MT向上相富集，從而使MT的分配系數和萃取率下降[21]，綜合考慮選擇PEG 2 000為成相物質。

2.1.2 PEG質量分數對MT萃取的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設定(NH4)2SO4質量分數20%、pH 6、溫度25 ℃，改變PEG質量分數，比較雙水相體系的MT分配系數及萃取率。由圖2可知，隨著PEG質量分數的增加，MT萃取率及分配系數隨之增加。此現象主要是由于PEG質量分數在一定范圍內增加，系統遠離臨界點，兩相性質的差別增大，利于MT富集于PEG相中。當PEG質量分數超過20%后，繼續增大PEG質量分數，成相物質分子間的作用、相界面張力、系統的黏度也會增大，導致溶質在相間的傳遞和在相內的擴散阻力增加，反而不利于MT進入PEG相，所以MT的分配系數及萃取率降低，故PEG質量分數為20%為最佳值。

2.1.3 (NH4)2SO4質量分數對MT萃取率的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設定PEG質量分數20%、pH 6、溫度25 ℃，改變(NH4)2SO4質量分數，比較雙水相體系的MT分配系數及萃取率。

從圖3可知，雙水相體系中(NH4)2SO4質量分數為20%時，MT的萃取率最高，隨著(NH4)2SO4質量分數繼續增大，不僅破壞了MT表面的水化層，使之發生鹽析，而且還會擾亂雙水相系統，改變各相中成相物質的組成和相體積比，下相水分含量升高，下相的體積增大，MT有不斷向下相分配的趨勢，所以MT萃取率逐漸下降。雖然(NH4)2SO4質量分數為25%時MT分配系數最大，但相比減小，萃取率減少，綜合考慮選擇(NH4)2SO4為20%為最佳值。

2.1.4 pH值對MT萃取率的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設定PEG質量分數20%、(NH4)2SO4質量分數20%、溫度25 ℃，改變pH值，比較雙水相體系MT分配系數及萃取率。

由圖4可知，雙水相體系的pH值為3～7時，MT萃取率及分配系數呈現先升高后降低的趨勢。當選擇雙水相體系為一種無機鹽和一種PEG時，鹽的正、負離子對兩相具有不同的親和力，它們在雙水相體系中的分配能力不同，上相顯示為正電性，下相顯示為負電性[22]。據報道酵母源MT的等電點在5.0左右[23]，當雙水相體系pH值大于MT等電點時，MT易富集于上相；當雙水相體系pH值小于MT等電點時，MT易于向下相富集。pH值的改變也會影響雙水相系統中無機離子的分配情況及兩相之間的電位差，從而影響MT的分配系數和萃取率。在pH 6時MT萃取率及分配系數均達到最大值，故體系的pH值在6左右為最佳。

2.1.5 溫度對MT萃取率的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設定PEG質量分數20%、(NH4)2SO4質量分數20%、pH 6，改變溫度，比較雙水相體系的MT分配系數及萃取率。

由圖5可知，體系的溫度20～40 ℃范圍內MT的萃取率及分配系數均有所上升，推測當溫度上升，雙水相體系內分子運動的加強降低了靜電排斥作用，使MT的分配系數和萃取率增加。但隨著溫度的升高，MT的分配系數和萃取率增加幅度較小，考慮到常溫條件下雙水相體系溶液的黏度低、易分相，實際生產中操作節省成本等問題，故體系的溫度設定為25 ℃。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 MT萃取響應面試驗設計與結果

依照表1的試驗因素與水平設計，采用Design-Expert 8.0.6軟件根據Box-Behnken設計，以MT萃取率作為響應值進行響應面優化試驗，結果見表2。

2.2.2 回歸方程的方差分析結果

通過 Design-Expert 8.0.6軟件模擬得到PEG質量分數（X1）、(NH4)2SO4質量分數（X2）、pH值（X3）對MT萃取率（Y）的二次多項回歸模型方程為:

方程中各因素系數絕對值大小反映了該因素對響應值的影響程度，系數的正、負反映影響的方向[24]。回歸方程方差分析如表3所示，該模型的P值小于0.000 1，失擬項（P＞0.05）不顯著，方程決定系數R2＞0.9，說明所選模型極為顯著，模型與真實值的擬合度較高。

2.2.3 響應面分析

雙水相萃取酵母源MT的響應面見圖6，結合表3回歸方程方差分析可知，各因素對MT萃取率影響大小為X1＞X3＞X2，即PEG質量分數對MT萃取率影響最大，其次為pH值及(NH4)2SO4質量分數。交互相中X1X3極顯著（P＜0.001），說明PEG質量分數與體系pH值間的交互作用較強，X2X3顯著（P＜0.05），說明(NH4)2SO4質量分數與pH值間的具有交互作用，PEG質量分數和(NH4)2SO4質量分數之間的交互作用不顯著。

2.2.4 確定最佳工藝條件

雙水相萃取酵母源MT的最佳工藝條件為常溫（25 ℃左右） PEG質量分數22.5%、(NH4)2SO4質量分數17.46%、pH 5.98，在此工藝條件下MT的萃取率可達81.87%。在此條件下進行3次平行實驗得到MT的萃取率為81.69%，與理論值差別較小，測定MT體外清除羥自由基能力是VC溶液的3.1 倍，與文獻報道基本一致[25]。以上實驗結果充分驗證了所建模型的正確性，所以此優化工藝條件是合理可行的。

3 結 論

雙水相萃取酵母源MT，在單因素的基礎上采用Box-Behnken試驗設計以及響應面分析，確定雙水相萃取最佳工藝為PEG相對分子質量2 000、PEG質量分數22.5%、(NH4)2SO4質量分數17.46%、pH 5.98，常溫（25 ℃左右）進行3 次萃取平行實驗，萃取率可達81.69%，與理論值81.87% 相差較小，MT體外清除羥自由基能力是VC溶液的3.1 倍，所以優化后的工藝條件是可行的。本實驗嘗試了一種步驟簡單、快速、適宜工業化生產的提取MT的方法，對相關研究具有一定的參考價值。

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Optimization of Extraction Process of Yeast Metallothionein by Aqueous Two-Phase System

WANG Yue1, ZHANG Dongjie1,*, WANG Ying1,2,*, LIANG Xiaoyue1, XU Bingzheng1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Daqing 163319, China)

In this study, an aqueous two-phase system consisting of polyethylene glycol (PEG) and ammonium sulfate was used to extract copper-induced metallothionein (MT) from a mutant strain of Saccharomyces cerevisiae. Response surface methodology was employed to optimize three factors namely PEG concentration, (NH4)2SO4concentration and pH that influence extraction efficiency using the software Design-Expert 8.0.6. The optimal aqueous two-phase system for MT extraction was determined to contain 22.5% PEG 2 000, 17.46% (NH4)2SO4at pH 5.98. Under these optimal conditions, the metallothionein was mainly distributed in the upper phase with an extraction rate of 81.69%. Therefore, this method can provide a new, simple, convenient, economical and highly efficient strategy for the extraction of metallothionein from yeast.

metallothionein; aqueous two-phase system extraction; response surface methodology; distribution coefficient; extraction rate

TS201.1

A

10.7506/spkx1002-6630-201510011

2014-10-17

黑龍江省教育廳新世紀人才項目(2014-2016)；黑龍江省博士后資助項目(LBH-Z13169)

王月(1990—),女,碩士研究生,研究方向為食品質量與安全。E-mail：wangy426@126.com

*通信作者：張東杰(1966—),男,教授,博士,研究方向為農產品加工及貯藏工程和食品質量安全。E-mail：zdj_66@126.com

王穎(1979—),女,副教授,博士,研究方向為農產品加工及食品質量與安全。E-mail：wychen156@163.com