翻白草中7 種黃酮和有機酸的超聲提取及含量測定

陳軍華,周光明,秦紅英,程洪梅,沈 潔

(西南大學化學化工學院,發光與實時分析教育部重點實驗室,重慶 400715)

翻白草中7 種黃酮和有機酸的超聲提取及含量測定

陳軍華,周光明*,秦紅英,程洪梅,沈 潔

(西南大學化學化工學院,發光與實時分析教育部重點實驗室,重慶 400715)

目的：建立高效液相色譜法分離測定翻白草中綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素7 種成分的方法。方法：采用Phenomenex C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)分離7 種成分；流動相為甲醇和pH 3的乙酸溶液,梯度洗脫；流速1.0 mL/min,紫外檢測波長350 nm,柱溫40 ℃。結果：7 種成分在20 min內均達到基線分離,線性關系良好(r＞0.999 5),平均回收率為84.61%～104.06%(相對標準偏差小于4.77%,n=3)。結論：翻白草中7 種活性成分的最佳提取條件為80%甲醇溶液、固液比1∶50(g/mL)、超聲功率160 W、超聲時間20 min。實際樣品的測定結果表明,翻白草中7 種活性成分的含量為：綠原酸121.5 μg/g、咖啡酸60.5 μg/g、金絲桃苷127.2 μg/g、槲皮素108.6 μg/g、柚皮素294.0 μg/g、山柰酚61.1 μg/g和芹菜素114.0 μg/g。

高效液相色譜；翻白草；黃酮類化合物；有機酸

翻白草(Potentilla discolor Bunge)為薔薇科植物翻白草的帶根全草,始載于《救荒本草》,其根肥厚,去皮色白,葉面青背白,故名翻白草。其味甘、微苦、性平,歸肝、胃大腸經,具有清熱解毒、涼血止血的功效,可用于治療肺熱咳喘、瀉痢、瘧疾、咳血、吐血、便血、崩漏、癰腫瘡毒等疾病[1]。國內外關于翻白草化學成分的研究[2-11]表明其主要成分為萜類、甾體、多酚類及黃酮類化合物。近幾年很多實驗[12-19]表明翻白草中的黃酮類化合物具有降血糖、治療糖尿病等功效,其中黃酮類化合物主要有槲皮素、山柰酚、芹菜素、金絲桃苷和柚皮素[20]等。目前,鮮有關于翻白草中黃酮類化合物定量測定的報道,石磊等[21]采用索氏提取法提取并測定了翻白草中的總黃酮,但該提取方法繁瑣且耗時；劉思曼等[22]用反相高效液相色譜僅僅測定了其中的槲皮素和山柰酚,本實驗首次實現了同時分離和測定其中的多種黃酮類化合物。另據文獻[23-26]報道綠原酸和咖啡酸具有保護DNA活性和抗氧化等多種藥理作用,故本實驗也對翻白草中的綠原酸和咖啡酸進行了分離和測定。本研究以高效液相色譜-紫外檢測(high performance liquid chromatography-ultraviolet,HPLC-UV)法作為分離測定手段,采用超聲波提取法前處理樣品,實現對翻白草中5 種黃酮類化合物和2 種有機酸的分離及含量測定,以期為翻白草的開發和利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

翻白草購于重慶藥房。

綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚、芹菜素對照品(純度均≥98.5%) 上海晶純實業有限公司；甲醇(色譜純)、乙酸(分析純) 重慶川東化工有限公司化學試劑廠；二次蒸餾水(實驗室自制)。

1.2 儀器與設備

LC-20A HPLC儀(包括SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵) 日本島津公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；SZ-2自動雙重純化水蒸餾器 上海瀘西分析儀器廠有限公司；XY型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：以甲醇為流動相B,乙酸(pH 3.0)為流動相A,進行梯度洗脫(0～5 min,30%→57% B；5～10 min,57%→57% B；10～15 min,57%→30% B；15～20 min,30%→30% B)；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：350 nm；柱溫：40 ℃。

1.3.2 對照品溶液的制備

精確稱取綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素對照品適量分別置于10 mL容量瓶中,甲醇溶解稀釋至刻度,得到質量濃度分別為500、500、742、550、680、570、560 μg/mL的對照品溶液。分別精確吸取綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚和芹菜素對照品溶液0.8 mL和柚皮素對照品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,制成混合對照品溶液,置于冰箱(4 ℃)內避光保存備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

精確稱取干燥粉碎的翻白草粉末(60 目篩)0.1 g,加入5 mL體積分數為80%甲醇溶液,超聲(160 W, 4 kHz)萃取20 min,萃取液離心(3 500 r/min)10 min,取上清液經0.45 μm有機濾膜過濾,取續濾液作為供試品溶液,按1.3.1節條件測定混合對照品和樣品。

2 結果與分析

2.1 混合對照品和樣品的色譜圖

混合對照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 流動相的選擇

比較乙腈-水、乙醇-水、甲醇-水、四氫呋喃-水作為流動相的分離效果。用乙腈和乙醇分別與水作為流動相時,槲皮素和柚皮素的分離效果很差；四氫呋喃-水作為流動相不能很好地分離山柰酚和芹菜素。當用甲醇-水作為流動相時各物質能夠彼此分離,但是綠原酸和咖啡酸的峰對稱性不好；進一步實驗了不同pH值的流動相以改善峰形,當用pH 3的乙酸溶液代替純水時,乙酸能抑制綠原酸和咖啡酸的解離從而有效改善其峰的前延和拖尾。開始嘗試用50%甲醇比例等度洗脫,7 種被測成分出峰時間太早,并且槲皮素和柚皮素以及山柰酚和芹菜素無法分開,逐漸減小甲醇比例,山柰酚和芹菜素勉強能夠分開,但是出峰時間太晚且峰形展寬嚴重。故最終選擇甲醇和pH 3的乙酸溶液作為流動相按1.3.1節中的梯度洗脫程序進行梯度洗脫。

2.2.2 提取溶劑的選擇

比較甲醇、乙醇和環己烷3 種提取溶劑的提取效果,發現甲醇的提取量明顯高于另外2種溶劑,故選擇甲醇作為提取溶劑。同時進一步考察不同比例的甲醇-水溶液對有效成分提取量的影響,實驗結果見圖2。甲醇的體積分數由60%增大至100%時,柚皮素的提取量明顯增大,其余6 種被測成分的提取量變化比較平緩。

2.2.3 超聲時間和功率的影響

超聲萃取時間和功率是影響提取量的重要因素,實驗比較了甲醇超聲10、20、30、40 min和50 min被測成分的提取量,結果見圖3。隨著超聲時間的延長,7 種被測成分的提取量不斷增大；超聲時間大于30 min后提取率增加不明顯。同時也考察了不同超聲提取功率對7 種被測成分提取量的影響。從圖4可以看出,超聲功率對各成分的提取量影響不是很大,在功率大于120 W時,除了柚皮素的提取量不大外,其余各成分基本達到最大的提取量。

2.2.4 波長和固液比的選擇

對比5 種黃酮類化合物在360 nm波長處都有較強的紫外吸收,再結合綠原酸和咖啡酸的測定波長,綜合考慮后確定350 nm作為檢測波長。比較固液比為1∶20、1∶30、1∶50、1∶80和1∶100(g/mL)的提取效果。圖5結果表明,不同成分隨固液比的變化趨勢不一樣,從1∶20～1∶100的變化中,綠原酸、金絲桃苷。柚皮素和芹菜素的提取量先增大后減小；另外3 種成分的提取量一直增大；在固液比為1∶50和1∶80的條件下,7 種成分的提取量相當。

2.3 正交試驗結果

綜合考慮單因素試驗結果,本實驗采用L9(34)正交試驗進一步優化各參數,其中主要考察甲醇體積分數、固液比、超聲時間和超聲功率4 個影響因素,各取3個水平。試驗中利用7 種成分的總提取量來評價萃取性能。正交試驗設計的結果及直觀分析見表1。

從表1極差R可知,各因素對7 種成分總提取量的影響程度依次為A＞B＞D＞C,即甲醇體積分數是影響總提取量的主要因素,固液比和超聲功率的影響次之,超聲時間的影響最小。比較k1、k2、k3的值可得提取7種成分的最佳條件為：A2B3C1D2,即甲醇體積分數80%、固液比1∶80、超聲時間20 min、超聲功率160 W。另外對比因素固液比的k2和k3的值發現兩者相差甚微(分別為685.500和688.567),即固液比為1∶50和1∶80的提取量相當,為了節約提取溶劑,選擇固液比為1∶50。故優化最終條件為：A2B2C1D2,即甲醇體積分數80%、固液比1∶50、超聲時間20 min、超聲功率160 W。

2.3 線性關系考察

精確吸取1.3.2節混合對照品溶液,以甲醇逐步稀釋成7 個不同質量濃度的混合對照品溶液。取不同質量濃度的混合對照品溶液按質量濃度由低到高依次進樣20 μL,在1.3.1節色譜條件進行分析。以對照品質量濃度為橫坐標X(μg/mL)、峰面積為縱坐標Y(10-3mV)進行線性回歸。7 種被測成分的線性關系考察結果見表2。

2.4 精密度

取混合對照品溶液重復進樣6 次,測定各個對照品的峰面積,結果綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)分別為1.37%、1.86%、1.91%、2.38%、1.03%、1.50%、2.65%,表明儀器精確度良好。

2.5 穩定性

精確吸取同一供試品溶液2 d內每間隔4 h進樣測定,結果綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素峰面積的RSD分別為2.52%、2.19%、0.66%、1.49%、2.13%、2.08%、2.19%,表明供試品溶液穩定性良好。

2.6 重復性

取同批樣品粉末5 份,按1.3.3節制備供試品溶液,重復進樣測定,計算綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素峰面積的RSD(n=5)分別為1.27%、2.50%、1.97%、2.01%、2.16%、1.60%、1.22%,表明儀器具有良好的重復性。

2.7 樣品的含量測定及回收率

稱取0.1 g樣品粉末3 份,按1.3.3節的方法制備供試品溶液,每份供試品溶液進樣分析3 次,根據表2中對應的線性方程計算樣品含量,結果見表3。稱取9 份翻白草樣品各0.1 g,分為3 組,每組按低、中、高分別加入一定量的對照品溶液,然后均依供試品制備方法、測定方法分析,每份重復進樣3 次,計算平均回收率,結果見表3。

3 結 論

本實驗利用HPLC-UV法,實現了翻白草中綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素7 種活性成分的同時分離及含量測定,取得了滿意的效果,實際樣品的測定結果表明：翻白草中7 種活性成分的含量為綠原酸121.5 μg/g、咖啡酸60.5 μg/g、金絲桃苷127.2 μg/g、槲皮素108.6 μg/g、柚皮素294.0 μg/g、山柰酚61.1 μg/g和芹菜素114.0 μg/g。采用超聲萃取前處理樣品,方法快速、簡單、經濟。分別考察了不同流動相、甲醇體積分數、固液比、超聲功率及時間對提取7 種被測成分的影響,優化得到最佳提取條件,為藥用植物翻白草的質量控制提供了實驗依據。

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Ultrasonic Extraction and Determination of Seven Flavonoids and Organic Acids in Potentilla discolor Bunge

CHEN Junhua, ZHOU Guangming*, QIN Hongying, CHENG Hongmei, SHEN Jie
(Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis (Southwest University), Ministry of Education, School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Objective: To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for separation and determination of chlorogenic acid, caffeic acid, hyperoside, quercetin, naringenin, kaempferol and apigenin in Potentilla discolor bunge. Methods: The separation of seven flavonoids and organic acids was performed on Phenomenex C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) with gradient elution. The mobile phase was a mixture of methanol and acetic acid (pH 3.0)at a flow rate of 1.0 mL/min and the UV detection wavelength was 350 nm. Results: Baseline separation of chlorogenic acid, caffeic acid, hyperoside, quercetin, naringenin, kaempferol and apigenin was achieved within 20 min. The calibration curves of the seven components showed linear relationships (r ＞ 0.999 5). The average recoveries were in the range of 84.61%-104.06% with a relative standard deviation (RSD) of less than 4.77%. Conclusion: The optimal extraction conditions for seven flavonoids and organic acids from Potentilla discolor Bunge were determined as follows: ethanol concentration, 80%; solid-to-liquid ratio, 1:50 (g/mL); ultrasonication power, 160 W; and ultrasonication time, 20 min. One gram of Potentilla discolor Bunge contained 121.5 μg of chlorogenic acid, 60.5 μg of caffeic acid, 127.2 μg of hyperoside, 108.6 μg of quercetin, 294.0 μg of naringenin, 61.1 μg of kaempferol, and 114.0 μg of apigenin as determined by this method.

high performance liquid chromatography (HPLC); Potentilla discolor Bunge; flavonoids; organic acids

TS201.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510019

2014-09-22

國家自然科學基金面上項目(21277110)

陳軍華(1989—),男,碩士研究生,研究方向為色譜分析。E-mail：chenjunh999@163.com

*通信作者：周光明(1964—),男,教授,博士,研究方向為色譜及其聯用技術。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn