120 ℃條件下模型體系烤牛肉風味的形成

劉森軒,彭增起,呂慧超,李君珂,王復龍,崔保威,劉世欣

(食品安全與營養協同創新中心,南京農業大學食品科技學院,江蘇 南京 210095)

120 ℃條件下模型體系烤牛肉風味的形成

劉森軒,彭增起*,呂慧超,李君珂,王復龍,崔保威,劉世欣

(食品安全與營養協同創新中心,南京農業大學食品科技學院,江蘇 南京 210095)

以牛肉酶解液為底物，通過添加糖、氨基酸和硫胺素進行美拉德反應，研究烤牛肉風味形成的最佳酶解條件和添加物配比。通過正交試驗確定牛肉最優酶解條件為:酶解溫度50 ℃、酶解pH 6.5、m（風味蛋白酶）∶m（復合蛋白酶）=1∶1、加酶量質量分數8%、酶解時間50 min；析因試驗確定美拉德反應模型體系最優配比為牛肉酶解液20 g、葡萄糖1.0 g、甘氨酸0.8 g、硫胺素0.3 g，120 ℃、pH 7.5條件下反應90 min。氣相色譜-質譜法分析結果表明，該模型體系烤牛肉特征風味物質（2-甲基-3-呋喃硫醇、2-甲基四氫噻吩-3-酮、雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫）相對含量較高。感官評定表明，該模型體系褐變程度高，吸光度最高為0.263，且肉香純正，烤牛肉風味濃郁。

牛肉酶解；美拉德反應；烤牛肉風味；氣相色譜-質譜法

牛肉含有重要的營養物質，對人體健康具有很大的益處[1]，而傳統烤牛肉制品因其獨特的顏色、香氣和口感也受到廣大消費者的青睞。雖然烤牛肉味道鮮美，但通常燒烤溫度在190～260 ℃條件下易產生雜環胺[2]、3,4-苯并芘[3]等具有致癌、致畸、致突變作用的物質。因此開展關于燒烤風味形成的研究，對保持燒烤肉制品獨特誘人風味的同時降低其帶來的危害具有重大意義。

熟肉風味物質不是單一化合物作用的結果，而是多種不同組成物質在數量上微妙平衡的產物，其顯著特征是以含硫化合物為主[4-5]。有研究表明，美拉德反應、脂質氧化和硫胺素的降解在烤肉風味形成過程中起到重要作用[6]，而美拉德反應在牛肉烤制過程中對色澤和風味變化起到了非常重要的作用[7-8]，Mottram[9]研究發現美拉德反應的Strecker降解階段會產生多種醛類化合物，隨后產生的呋喃類、吡嗪類、噻吩類物質也是重要的香味物質成分。

本研究以牛背最長肌為原料，利用復合蛋白酶和風味蛋白酶2 種酶[10-11]對其進行水解，通過考慮酶解溫度、酶解時間、酶解pH值、酶配比及加酶量5 個因素，找出最佳牛肉酶解工藝；再以牛肉酶解液為底物，設計美拉德反應析因試驗，通過研究葡萄糖、甘氨酸和硫胺素的添加量對反應產物褐變程度和感官品質的影響，確定形成燒烤風味的最佳物質配比，探索溫和條件下（120 ℃）烤牛肉風味的形成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛背最長肌（江蘇黃牛）購于南京市玄武區衛崗農貿市場。

氫氧化鈉、甲醛、鹽酸（均為分析純） 南京化學試劑有限公司；復合蛋白酶、風味蛋白酶、葡萄糖、甘氨酸、硫胺素（均為食品級） 河南金潤食品添加劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1Litre組織搗碎機 德國Waring Commerical公司；HH-600三用恒溫水箱 金壇市杰瑞爾電器有限公司；Allegra 64R型高速冷凍臺式離心機、DU 730型紫外-可見分光光度計 美國Beckman Coulter有限公司；DGG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；HJ-3型數顯恒溫磁力攪拌器 金壇市宏凱儀器廠；AL 104電子分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；8400全自動凱氏定氮儀 上海展儀儀器設備有限公司；SCION SQ 456-GC氣相色譜-質譜聯用儀美國Brüker公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉中總氮含量的測定

采用全自動凱氏定氮儀進行測定[12]。將解凍的牛肉樣品剔除可見脂肪、肌內膜和肌間膜并絞碎，稱取0.2 g上述樣品以及1 塊消化片（硫酸鉀和硫酸銅混合物）和12 mL濃硫酸于消化管中，消化1.5 h（420 ℃），用凱氏定氮儀測定樣品中氮的含量。

1.3.2 牛肉酶解正交試驗設計

根據前期試驗結果[13]，選定酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶解pH值（C）、酶配比（D）、加酶量（E），5 個因素為正交試驗研究對象，每個因素設4 個水平，如表1所示，根據因素水平個數選擇相應的正交試驗表，進行試驗，每組試驗2 次重復，3 個平行。

1.3.2.1 牛肉酶解液的制備

取適量牛肉，剔除可見脂肪，置于高速組織搗碎機10 000 r/min處理1 min。稱取肉糜10 g，移入三角瓶中，加入一定量蒸餾水，底物質量分數30%左右，升溫至90 ℃熱變性處理10 min，冷卻后用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調節pH值，加入適量復合蛋白酶和風味蛋白酶，攪拌均勻，在一定溫度條件下酶解一段時間后升溫至95 ℃滅酶10 min。在4 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液待分析測定[14]。

1.3.2.2 牛肉酶解液水解度的測定

采用甲醛滴定法測定水解度[15-16]。吸取5 mL樣品溶液稀釋至100 mL，再吸取20 mL稀釋液置于200 mL燒杯中，加60 mL去離子水，用標準NaOH（0.05mol/L）溶液滴定至pH 8.20，加入10 mL體積分數36%甲醛溶液，混勻后繼續滴定至pH 9.20，記錄加入甲醛后消耗的NaOH溶液體積，重復3 次。

空白實驗，除不加酶解液外，所有步驟同酶解實驗。按公式（1）、（2）計算氨基酸態氮含量和水解度。

式中:V0為空白實驗消耗的標準NaOH溶液體積/mL；V1為樣品消耗的標準NaOH溶液體積/mL；C為標準NaOH溶液濃度/（mol/L）；m為測定用樣品溶液相當于樣品的質量/g；0.014為氮的毫摩爾質量/（g/mmol）；N0為樣品總氮含量/（g/100 mL）；N1為酶解前游離氨基酸態氮含量/（g/100 mL）；N2為酶解后游離氨基酸態氮含量/（g/100 mL）。

1.3.3 美拉德反應析因試驗設計

在前期試驗基礎下，發生美拉德反應的葡萄糖、甘氨酸、硫胺素分別設定一個高水平和一個低水平，以褐變程度和感官品質作為評定指標。析因試驗是一種對所有因素的所有水平組合進行全面試驗和分析的方法，其在試驗因素較少、水平數較少的情況下能十分有效地得出最優試驗方案[17]。本研究采用三因素二水平進行8 次試驗，如表2所示，每組試驗2 次重復，3 個平行。

1.3.3.1 美拉德反應產物褐變程度的測定

以20 g牛肉酶解液為底物，加入葡萄糖、甘氨酸、硫胺素，用NaOH溶液調節反應體系pH 7.5，常壓條件下，放入恒溫干燥箱中120 ℃條件下反應90 min。反應產物冷卻至室溫后稀釋10 倍，在波長420 nm處測其吸光度[18]。

1.3.3.2 美拉德反應產物感官品質的評定

將反應后的每組樣品稀釋至同一體積分數，按順序進行編號，采用10 分評分制。對各組樣品的氣味強度評分，由經過培訓的10 名評價員對各樣品評分，結果取平均值[19]。感官評分標準見表3。

1.3.4 美拉德反應液燒烤風味GC-MS測定

參考Matthias等[20]的方法，并稍作改動。固相微萃取:取3 g左右樣品置于15 mL頂空瓶中，將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。

氣相色譜條件:采用DB-Wax色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣；氣體流速為0.9 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；柱箱采用程序升溫:初始溫度為40 ℃，然后以5 ℃/min升溫至90 ℃，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持7 min。

質譜檢測條件:采用電子電離源正離子模式；電子能量70 eV；發射電流80 μA；檢測器電壓1 000 V。

1.4 數據分析

試驗數據通過SPSS 19.0在顯著性水平P=0.05條件下進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 牛肉總氮含量

根據國家標準的方法采用全自動凱氏定氮儀測得牛背最長?。ńK黃牛）的總氮含量為（4.28±0.21） g N/100 g。

2.2 牛肉酶解條件的優化

由表4可以看出，根據極差分析各因素影響牛肉酶解液水解度的主次順序為:E＞A＞D＞C＞B。由于試驗結果要求較大的水解度，所以應挑選每個因素K值中最大值對應的水平組合作為牛肉酶解的最優工藝條件，由試驗結果可知最優工藝條件組合為A2B4C3D3E4。但該組合在上述正交試驗中并沒有出現，故需進行驗證實驗。結果表明，A2B4C3D3E4條件下測得水解度為17.24%，高于正交試驗中的最好結果15.15%，所以確定牛肉酶解液的最優工藝條件為:酶解溫度50 ℃、酶解時間50 min、酶解pH值為6.5、m（風味蛋白酶）∶m（復合蛋白酶）=1∶1、加酶量質量分數8%。

從正交試驗的結果中還可以發現5 個試驗因素中加酶量對牛肉水解度的影響最大（R值最大），說明在實際生產中要著重考慮加酶量對牛肉酶解的影響。

2.3 美拉德反應產物析因試驗結果

由美拉德反應模型體系試驗結果（表5）可以看出，吸光度大小代表褐變程度的強弱，當葡萄糖、甘氨酸為高水平，硫胺素為低水平時，吸光度最大為0.263。當葡萄糖含量一定時，隨著甘氨酸含量的增加，褐變程度及感官品質顯著增加（P＜0.05），隨著硫胺素含量的增加，褐變程度下降，感官品質增加，但均不顯著（P＞0.05）；當甘氨酸和硫胺素含量一定時，隨著葡萄糖含量的增加褐變程度及感官品質顯著增加（P＜0.05）。

分別對試驗結果進行方差分析，如表6、7所示，3 個因素葡萄糖、甘氨酸、硫胺素對褐變程度都有顯著影響（P＜0.05）；葡萄糖與甘氨酸、甘氨酸與硫胺素之間存在交互作用且對褐變程度影響顯著（P＜0.05）；葡萄糖、硫胺素之間，葡萄糖、甘氨酸、硫胺素三者之間不存在交互作用或交互作用不顯著（P＞0.05）。將3 個因素按照對褐變程度影響的重要程度分類，由F值大小可知，甘氨酸是最主要因素，葡萄糖為主要因素，硫胺素為次要因素。同時，葡萄糖、甘氨酸的含量變化對感官品質的影響較為顯著（P＜0.05），而硫胺素對其影響不顯著（P＞0.05）；葡萄糖、甘氨酸之間存在交互作用且對感官品質影響顯著（P＜0.05）；葡萄糖與硫胺素、甘氨酸與硫胺素之間，葡萄糖、甘氨酸、硫胺素三者之間在對反應液感官品質的影響不存在交互作用或交互作用不顯著（P＞0.05）。將3 個因素按照對感官品質影響的重要程度分類，由F值大小可知，甘氨酸是最主要因素，葡萄糖為主要因素，硫胺素為非主要因素。

綜上所述，甘氨酸是影響反應液褐變程度和感官品質最主要的因素，由試驗結果可以看出高水平的甘氨酸能顯著提高反應液的品質，即甘氨酸0.8 g；葡萄糖對反應液的褐變程度和感官品質也有著重要影響，高水平的葡萄糖對反應液的品質影響較大，故葡萄糖1.0 g；硫胺素對結果影響不大，從生產成本的角度考慮，低水平的硫胺素較好，即硫胺素0.3 g。所以通過析因試驗確定3 個因素的最佳配比為葡萄糖1.0 g、甘氨酸0.8 g、硫胺素0.3 g。

2.4 揮發性風味物質氣相色譜-質譜法分析

通過氣相色譜-質譜法對最優配比條件下的美拉德反應液經頂空固相微萃取后的揮發性成分進行定性分析。根據計算機標準質譜圖庫檢索、各組分的質譜圖及數據分析，并通過峰面積歸一化相對含量，結果如圖1、表8所示。

揮發性成分中共檢測出56 種化合物，主要是羧酸類（1.269%）、醛類（28.451%）、酮類（20.723%）、雜環類（45.342%，包括呋喃類、噻唑類、噻吩類等）、含硫化合物（33.666%）。從檢測結果來看，反應液中含有較豐富的2-甲基-3-呋喃硫醇（6.008%），是肉香香氣的主要原料，具有明顯的肉香氣味[21]，因此反應液肉香十分濃郁。檢測出的風味物質中雜環類物質的相對含量最多（45.342%），噻吩及噻唑類化合物中的烷基或乙?；〈锒嗑哂袌怨恪⒖鞠恪⑷庀悖恍┻€具有水果的香氣，對牛肉香氣的形成起到非常重要的作用。這與早期Guy等[22]的研究是一致的。反應液中檢測出2-甲基四氫噻吩-3-酮、雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫等烤牛肉的特征風味物質。此外，硫醇類物質作為烤肉類揮發性物質中主要的成分之一[23]，在反應液中也被檢測到，且相對含量（13.193%）較為豐富。反應液通過氣相色譜-質譜法檢測出的多種化合物，尤其是烤牛肉的特征風味物質，使得反應液具有明顯的烤牛肉風味，這與之前感官評定的結果是一致的。

3 結 論

在酶解溫度50 ℃、酶解pH值為6.5、m（風味蛋白酶）∶m（復合蛋白酶）=1∶1、加酶量質量分數8%的條件下，反應50 min后可得水解度為17.24%的牛肉酶解液。常壓條件下，20 g牛肉酶解液中添加葡萄糖1.0 g、甘氨酸0.8 g、硫胺素0.3 g，反應體系在pH值為7.5，120 ℃條件下反應90 min，反應體系產物吸光度為0.263，褐變程度較高，且肉香純正，烤牛肉風味濃郁。氣相色譜-質譜分析表明，美拉德反應模型體系反應液中含有多種烤牛肉特征揮發性風味物質如2-甲基-3-呋喃硫醇、2-甲基四氫噻吩-3-酮、雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫，與感官評定結果一致。

[1] MCAFEE A J, MCSORLEY E M, CUSKELLY G J, et al. Red meat consumption: an overview of the risks and benefits[J]. Meat Science, 2010, 84(1): 1-13.

[2] QUELHAS I, PETISCA C, VIEGAS O, et al. Effect of green tea marinades on the formation of heterocyclic aromatic amines and sensory quality of pan-fried beef[J]. Food Chemistry, 2010, 122(1): 98-104.

[3] 劉興勇, 朱仁俊. 熏烤肉制品風味和有害物質的形成及其防止方法[J]. 食品工業科技, 2010, 31(5): 405-410.

[4] 周潔, 王立, 周惠明. 肉品風味的研究綜述[J]. 肉類研究, 2003, 17(2): 16-18.

[5] 向智男, 寧正祥. 肉品風味的形成與美拉德反應[J]. 廣州食品工業科技, 2004, 20(2): 143-147.

[6] 張恬靜, 李洪軍. 烤肉加工與香氣分析研究進展[J]. 食品工業科技, 2009, 30(4): 330-332.

[7] 陳華. 影響食品中美拉德反應的因素[J]. 四川食品與發酵, 1998(3): 20-23.

[8] MARTINS S I, BOEKEL M A. Kinetics of the glucose/glycine Maillard reaction pathways: influences of pH and reactant initial concentrations[J]. Food Chemistry, 2005, 92(3): 437-448.

[9] MOTTRAM D S. Flavors formation in meat and meat products: a review[J]. Food Chemistry, 1998, 62(4): 415-424.

[10] 李宏梁, 馬雅鴿. 酶法制備肉味香精及其風味調配的研究[J]. 中國調味品, 2006, 31(10): 45-48.

[11] 武彥文, 張燕, 閻晶辰. 酶法水解植物蛋白制備肉味香精的研究[J].食品工業科技, 2003, 24(3): 53-55.

[12] 衛生部食品衛生建筑檢驗所. GB 5009.5—2010 食品中蛋白質的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[13] 蘇暢, 黃家冀. 牛肉酶解工藝的研究[J]. 食品科技, 2009, 34(6): 94-96.

[14] 趙中勝, 鐔雪瑩, 查思輝, 等. 牛肉香精制備工藝的研究[J]. 食品研究與開發, 2013, 34(9): 54-56.

[15] 夏玲君. 反應型牛肉香精的研制及其香味活性化合物的分析[D]. 北京: 北京工商大學, 2007: 22-23.

[16] 張水華. 食品分析[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2004: 174-175.

[17] 汪仁官, 陳榮昭. 實驗設計與分析[M]. 北京: 中國統計出版社, 1998: 396-481.

[18] 黃文, 胡慰望, 謝筆均. 脫脂花生蛋白酶解產物的焙烤香味研究[J].食品科學, 1997, 18(4): 40-44.

[19] 朱紅, 黃一貞, 張弘. 食品感官分析入門[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1993: 76-85.

[20] MATTHIAS G, JURGEN B, ROLAND E, et al. Identification and formation of some selected sulfur-containing flavor compounds in various meat model systems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38(11): 2027-2041.

[21] ROCHAT S, CHAINTREAU A. Carbonyl odorants contributing to the in-oven roast beef top note[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(24): 9578-9585.

[22] GUY J H, JAMES T C, JIIRGEN D S, et al. Volatile products formed from the thermal degradation of thiamin at high and low moisture levels[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1984, 32(5): 1015-1018.

[23] SABINE R, JEAN-YVES S L, ALAIN C. Analysis of sulfur compounds from the in-oven roast beef aroma by comprehensive twodimensional gas chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1147(1): 85-94.

Formation of Roast Beef Flavor in Model System at 120 ℃

LIU Senxuan, PENG Zengqi*, L? Huichao, LI Junke, WANG Fulong, CUI Baowei, LIU Shixin
(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, the enzymatic hydrolysis conditions of beef and the proportions of added sugar, amino acids and thiamine were optimized to build a Maillard reaction model system for generating roast beef flavor. By using orthogonal array design, the optimum enzymatic hydrolysis conditions were determined to be hydrolysis at 50 ℃ for 50 min with 8% of a mixture of flavourzyme (F) and protamex (P) at a mass ratio of 1:1 with an initial pH of 6.5. The optimal Maillard reaction system developed using a factorial design consisted of 20 g of beef hydrolysate, 1.0 g of glucose, 0.8 g of glycine, 0.3 g of thiamine, and the reaction was proceeded at 120 ℃ for 90 min with an initial pH of 7.5. The gas chromatographymass spectrometry (GC-MS) results demonstrated that the contents of 2-methyl-3-furanthiol, 2-methyl tetrahydrothiophen-3-ketone and 3,3’-disthiobis[2-methyl-furan] were relatively high, which featured the roast beef flavor. Overall, this model system was characterized by high degree of browning, the highest absorbance (0.263), inviting meat flavor and strong roast flavor as indicated by sensory evaluation.

enzymatic hydrolysis of beef; Maillard reaction; roast beef flavor; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS251.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510024

2014-09-26

國家現代農業產業技術體系建設專項(NYCYTX-38)

劉森軒(1989—),女,碩士研究生,研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail：lsenxuan@163.com

*通信作者：彭增起(1956—),男,教授,博士,研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail：zqpeng@njau.edu.cn