N MR 氫譜定量測定奶酪中總共軛亞油酸的含量

(北京市食品安全監控和風險評估中心,北京 100041)

N MR 氫譜定量測定奶酪中總共軛亞油酸的含量

李 瑋,姜 潔,路 勇,何 濤,李 龍,王 振

(北京市食品安全監控和風險評估中心,北京 100041)

目的:建立用核磁共振定量法測定奶酪中總共軛亞油酸含量的方法，并與紫外分光光度法進行比較。方法:以1,2,4,5-四甲基苯為內標，采用5 mm BBO探頭、脈沖序列noesyig1d、探頭溫度300 K、掃描次數128 次、脈沖延遲時間（D1）10 s。結果:該方法的加樣回收率為93.33%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為4.20%；精密度RSD為0.99%，重復性RSD為3.17%，穩定性RSD為1.81%。結論:該方法前處理簡單，無需標準品做參比，在對目標物完成定性、定量分析的同時還可以實現對非目標物的定性分析。與紫外分光光度法相比，該方法具有更好的專屬性。

核磁共振定量法；奶酪；共軛亞油酸；定量測定

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是一類含有共扼雙鍵的十八碳二烯酸（亞油酸）同分異構體的總稱[1]。天然來源的CLA主要存在于反芻動物的肉及乳制品中，是人體不可缺少的脂肪酸之一。近年來的研究表明，CLA具有抗癌[2-5]、抗動脈粥樣硬化[6-11]、增強機體免疫力[12]、促進骨形成等多種生理功能[13]。其中起關鍵作用的2 種主要異構體為c9,t11-CLA和t10,c12-CLA，在乳制品中這2 種異構體分別占總CLA的75%～90%和5%。

乳制品是人體日常攝入CLA的主要來源，而奶酪是具有極高營養價值的濃縮乳制品，被譽為乳品中的“黃金”。隨著國內市場對奶酪制品消費量的大幅增加，建立一種快速、準確、簡便的奶酪等乳制品中的CLA定性和定量分析方法十分必要。目前針對CLA的分析方法主要有紫外分光光度法[14-15]、高效液相色譜法[16]、氣相色譜法[17-18]等。但這些方法存在著前處理過程操作繁瑣、費時，樣品和試劑消耗量大，會受到其他成分信號的干擾等缺點。核磁共振定量（quantitative nuclear magnetic resonance，QNMR）分析方法以結構測定為基礎，具有前處理過程簡單，取樣量小，專屬性強，無需對照品做參比即可同時定性、定量等優點，已被廣泛的用于藥物分析[19-20]、食品科學[21-22]等研究領域。本研究采用1H-NMR內標定量法，建立了無需對照品的快速、專屬、簡單的奶酪中總CLA含量的測定方法，考察了實驗條件的影響，用絕對定量和標準曲線模式測定了7 種市售奶酪樣品中總CLA的含量，并與紫外分光光度法進行了比較，為奶酪等乳制品的品質評價提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7 種奶酪樣品購于北京市超市，置于4 ℃冰箱保存。

正己烷（分析純） 北京化工廠；標準品:1,2,4,5-四甲基苯、c9,t11-CLA、t10,c12-CLA（純度≥99%）美國Sigma公司；氘代氯仿（CDCl3，氘代度:99.8%）美國CIL公司。

1.2 儀器與設備

AVANCE 600MHZ超導傅里葉變換NMR儀（配有BBO探頭和Topspin 3.2處理軟件） 瑞士Bruker公司；Lambda 35紫外分光光度計 美國Perkin Elmer公司；XS204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；TissueLyserⅡ均質器 德國Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

稱取適量的1,2,4,5-四甲基苯標準品，用CDCl3溶解并定容，搖勻，制得0.2 mg/mL的內標儲備液。稱取c9,t11-CLA、t10,c12-CLA標準品各25 mg置于同一5 mL棕色容量瓶中，用CDCl3溶解并定容，搖勻，制得10 mg/mL的標準品儲備液，-20 ℃冰箱中儲存備用。

1.3.2 供試品溶液的制備

稱取奶酪樣品約1 0 0 m g于離心管中，加入1 mL CDCl3后置于均質器中均質30 s（30 Hz），過濾。分別移取500 μL樣品濾液和100 μL內標儲備液于5 mm核磁管中，制得供試品。

1.3.3 NMR測定條件

1H-NMR、1D-TOCSY、1H-H COSY、HSQC、HMBC使用Bruker標準脈沖程序，檢測溫度均為300 K，掃描次數（scanning number NS）分別為128、32、8、8、80 次，1D-TOCSY的混合時間D9設為0.075 s。1D-TOCSY為一維選擇性實驗技術，在混合物解析中發揮著重要作用，能夠得到激發核以及與其在同一個自旋體系的質子的信號；1H-H COSY技術能夠給出相鄰碳上氫的關系，HSQC技術能給出直接相連的碳氫關系；HMBC技術能給出遠程耦合的碳氫關系。

定量實驗:使用Bruker標準實驗參數ASSURE-1H，脈沖序列Noesyig1d，檢測溫度300 K，1H的90°脈沖寬度P110.32 μs，譜寬7 211.54 Hz，中心頻率2 700.59 Hz，脈沖延遲時間D1為10 s，混合時間D80.01 s，13C的去耦序列90°脈沖260 μs，掃描次數128次，空掃次數4次。

1.3.4 供試品溶液的測定

測定前，使用標準管（90% H2O+10% D2O）對儀器進行3D勻場，使用ASTM標準管精確校準探頭90°脈沖寬度。在1.3.2節測定條件下，測定供試品的1H-NMR譜圖。所有圖譜使用Bruker Topspin 3.2軟件處理，變換點數為96 000，用指數窗函數處理，LB為1.00 Hz，基線和相位校正均采用手動方式進 行。每個供試品的積分面積取5 次積分的平均值。按以下公式計算供試品中CLA的絕對含量。

式中:W為物質的質量/mg；A為定量峰積分面積；N為定量峰所包含的質子數；M為物質相對分子質量；下標u及r分別為分析物和內標物。本實驗中的Nu=1，Nr=2，Mu=280.44，Mr=134.22，Wr=0.02 mg。

1.3.5 標準溶液的配制及曲線繪制

準確吸取80、50、20、10、5 μL標準儲備液，分別置于已加有100 μL內標儲備液的5 支核磁管中，各加一定體積的CDCl3溶液至500 μL，配制成含質量分別是0.8、0.5、0.2、0.1、0.05 mg的標準樣品，以1.3.3節中的測定條件進行1H-NMR分析。以積分得到的標準品定量峰面積與內標峰峰面積比值為Y軸，以加入標準品質量與加入的內標質量的比值為X軸做標準曲線。

1.3.6 紫外分光光度法測定

用正己烷配制成質量濃度為2、5、8、10、20 μg/mL的一系列CLA對照品溶液，按照紫外-可見分光光度法，在234 nm波長[14-15]處測定吸光度，繪制標準曲線。稱取奶酪樣品約100 mg于離心管中，加入1 mL正己烷后，置于均質器中均質30 s（頻率為30 Hz），過濾。吸取500 μL樣品濾液于25 mL容量瓶中，加適量正己烷定容，搖勻。吸取適量溶液，在234 nm波長處測定吸光度，根據所得標準曲線計算樣品中CLA的含量。

2 結果與分析

2.1 定量特征峰、定量內標的選擇

測定供試品溶液的1H-NMR譜，結果見圖1。其中，δ0.50～2.50（圖1a）信號為CLA和其他脂肪酸的飽和質子信號，δ4.10～4.36（圖1b）和δ5.27（圖1c）信號為甘油三酯中丙三醇的質子信號，δ5.30～5.43（圖1d）信號為非共軛脂肪酸不飽和質子信號，這些信號相互堆積重疊，不易辨識。由于共軛系統的存在，CLA的4 個共軛不飽和質子出現在低場區（δ5.20～6.50），其中δ5.33的質子信號被非共軛脂肪酸不飽和質子信號覆蓋，余下3 個共軛不飽和質子信號（δ5.67、δ5.96和δ6.30）與其他脂肪酸信號無重疊，易于辨認。供試品及標準品的檢測結果顯示，δ5.67信號積分面積值不穩定，并結合文獻[23-24]報道，選擇δ5.96（圖1e）和δ6.30（圖1f）2 個質子信號峰作為定量峰，最終以這2 個質子信號積分面積的均值作為計算供試品中總CLA含量的定量積分面積值。

QNMR所選內標應滿足純度高，能與被測樣品溶于同一種溶劑，不與被測樣品及溶劑反應，定量信號峰易于識別，并且至少要保證有一組峰與被測物完全分離等要求。因此，本實驗選用1,2,4,5-四甲基苯為定量內標，其苯環上的2 個質子在化學位移為δ6.92（圖1g）處有一尖銳單峰（1H-NMR CDCl3），故選定此峰為內標定量特征信號峰。

2.2 QNMR定量參數考察

脈沖延遲時間的考察:取1.3.5節中制備的含0.1 mg標準品核磁管，分別設D1為2、4、8、10、15、20 s，NS為48 次，余下參數按1.3.3節下條件上機檢測，考察D1對定量峰與內標峰積分面積比值（AS為CLA兩個定量信號積分面積的均值；AR為內標定量信號積分面積）的影響，結果見表1。結果顯示，當D1≥10 s時，相對積分面積穩定，因此，確定實驗的D1為10 s。

掃描次數的考察:取1.3.5節中制備的含0.1 mg標準品核磁管，分別設NS為8、16、32、48、64、128、256 次，余下參數按1.3.3節下條件上機檢測，考察NS對定量峰RSN的影響，結果見表2。在NMR定量實驗中，NS較少會造成數據重復性差，較多會使數據重復性好，提高信噪比，但同時也會延長實驗時間。綜合考慮，本實驗中取NS為128 次，此時定量峰的RSN大于100。

2.3 線性關系

以積分得到的標準品定量峰面積與內標峰面積比值為縱坐標（AS/AR）為縱坐標，以加入的標準品質量與加入的內標質量的比值為橫坐標做線性回歸。在標準品與內標質量比為2.5～40范圍內，得回歸方程y = 3.847 9x+ 0.406 8，R2 = 0.999 9，表明本方法線性關系良好。

2.4 精密度

將按1.3.2節方法制備的供試品在1.3.3節下條件平行測定6 次，計算樣品中AS/AR的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.99%。確認方法精密度良好。

2.5 重復性

按1.3.2節下方法平行制備6 份供試品溶液，在1.3.3節條件下測定1H-NMR圖譜，計算樣品中AS/AR的RSD為3.17%，確認方法重復性良好。

2.6 穩定性

取同一供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24、48 h，在1.3.3節條件下測定1H-NMR圖譜，計算各時間點圖譜AS/AR的RSD為1.81%，確認供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.7 加標回收率

平行稱取同一品牌的奶酪樣品9 份，其中3 份作為對照，另外6 份各加入10 μL質量濃度為10 mg/mL的標準儲備液。按1.3.2節下方法制備供試溶液，在1.3.3節條件下測定1H-NMR圖譜，計算回收率和RSD，結果見表3。

2.8 樣品測試結果

稱取不同品牌的奶酪樣品,每個品牌3 個平行(n=3),制備供試品溶液,測定1H-NMR圖譜,并計算樣品中CLA的含量。再采用紫外分光光度法測定樣品中CLA的絕對含量,結果見表4。

結果顯示，NMR絕對定量法和NMR標準曲線法所得到的結果基本相符（RSD在4%以內）；所有樣品的紫外分光光度法的檢測值均大于NMR絕對定量法的檢測值，其中1、3、5號樣品的紫外分光光度法的測定值明顯大于對應的NMR絕對定量法測定值（RSD大于20%）。通過對比1號樣品和2號樣品的1H-NMR圖譜（圖2），發現1號樣品在δ5.20～7.40范圍有幾組多出信號，其中δ7.32（dd, 10.8, 15.2 Hz）、δ5.80（d, 15.2 Hz）耦合常數在15 Hz左右，具有典型的反式雙鍵上質子特征。1D-TOCSY技術能夠得到激發核以及與其在同一個自旋體系的質子的信號，而非該自旋體系的其他質子信號則不出現在譜圖中。對1號樣品采用1D-TOCSY技術，選擇性照射δ7.32的質子，得出δ7.32、δ6.21、δ5.80、δ1.88信號質子處于同一自旋體系內（圖3）。1H-NMR譜δ6.21處的信號為多重峰，不易辨識，通過HSQC，得出此處的多重峰為2 個質子譜峰的重疊，化學位移分別為δ6.22和δ6.20（圖4），并且進一步得出δ146.8、δ129.8、δ139.8、δ117.75、δ18.6碳原子分別與δ7.32、δ6.22、δ6.20、δ5.80、δ1.88質子直接相連。通過1H-1H COSY圖譜，可以觀察到δ7.32處信號分別與δ6.22及δ5.80兩個信號峰相關，δ6.20信號峰和δ1.88信號峰相關（圖5），得出5 個質子的連接順序。HMBC譜中，δ7.32、δ5.80 2 個質子均與δ169.8的碳信號相關（圖6），結合δ5.80質子信號的峰形，推斷此雙鍵中δ117.75的碳與羧基相連。結合質譜測定結果，確認此成分為山梨酸（2,4-己二烯酸，圖7）。3、5號樣品的1H-NMR圖譜與1號樣品相似，說明其中也含有山梨酸成分。

紫外分光光度法是利用CLA中存在的共軛雙鍵在234 nm波長處有特征吸收，而非共軛亞油酸及其他脂肪酸在該波長處沒有吸收的原理來測定樣品中CLA含量的。由于山梨酸分子中也含有共軛雙鍵結構，在234 nm波長處同樣有吸收，所以最終導致1、3、5號樣品紫外分光光度法測定的CLA值顯著偏高。2、4、6、7號樣品的紫外分光光度法的檢測值也均大于NMR絕對定量法的檢測值，考慮到檢測樣品成分復雜性，并結合紫外分光光度法的特點，推測可能是樣品中也含有在測定波長處具有紫外吸收的雜質。

3 結 論

目前的文獻報道多見以QNMR內標法對藥物制劑或化學對照品進行含量測定[25-26]，少見對食品中的營養成分進行絕對含量測定的文獻報道。本實驗以1,2,4,5-四甲基苯為內標，建立了奶酪中總CLA含量的QNMR分析方法。9c,11t-CLA、10t,12c-CLA標準品的1H-NMR（CDCl3）測定結果顯示，兩者所含的4 個共軛質子信號完全相同，并且乳制品中的CLA以這2 種異構體為主，因此，本實驗中選取的定量峰能夠代表樣品中總CLA的含量。結果表明，本方法精密度、穩定性、重復性良好，專屬性高，樣品前處理簡單，無需高純度標準品做參比，可同時完成定性和定量分析。

與NMR定性圖譜相比，QNMR實驗對圖譜的質量要求更高。由于13C自然豐度遠低于1H，所以在1H-NMR圖譜中13C對1H的耦合作用較小。因此，在對藥物制劑、化學對照品這類基質簡單，分析物的相對含量較高的樣品進行分析時，常采用zg、zg30等不對碳去耦的脈沖序列進行實驗。但本實驗中的分析對象的基質復雜，目標分析物CLA的相對含量較低，對圖譜的峰形、基線、相位的質量要求更高。因此，本實驗采用Noesyig1d脈沖序列，對13C去耦，能夠消除樣品1H-NMR信號的衛星峰，增加定量準確性，同時還能提高基線平滑度，更適合復雜基質中微量成分的QNMR定量。

紫外光譜儀器較NMR儀價格便宜，普及率高，但易受其他成分的干擾，專屬性較差。NMR測定結果與紫外分光光度法測定結果的比較顯示，NMR的抗干擾能力明顯優于紫外法。因此在進行CLA分析時，應充分考慮樣品的性質和各分析方法的特點等來選擇佳的檢測方法。特別是對使用山梨酸作為防腐劑的食品樣品進行CLA含量測定時，要避免使用紫外分光光度法。同時，由于QNMR法以結構測定為基礎，除了能完成對目標物的分析外，還能夠結合多種1D、2D-NMR技術，進一步給出非目標物的結構信息，完成對待測樣品中非目標物的篩查和定性分析，使被動檢測風險變為主動的發現風險，為食品安全監控工作提供了一條新思路。

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Determination of Total Conjugated Linoleic Acid Content in Cheeses by Quantitative Nuclear Magnetic Resonance (QNMR)

LI Wei, JIANG Jie, LU Yong, HE Tao, LI Long, WANG Zhen
(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment, Beijing 100041, China)

Objective: To establish a method for the determination of total conjugated linoleic acid (CLA) content in cheeses by quantitative nuclear magnetic resonance (QNMR) and to compare its effectiveness with that of ultraviolet spectrophotometry. Methods: The analysis employed 1,2,4,5-tetramethylbenzene as internal standard, and a 5-mm Bruker broadband observe (BBO) probe, working at 300 K with a pulse sequence of Noesyig1d, 128 scans and a pulse delay time (D1) of 10 s. Results: The recovery rate was 93.33% with relative standard deviation (RSD) of 4.20%. The precision RSD was 0.99%, the reproducibility RSD was 3.17% and the stability RSD was 1.81%. Conclusion: This method enables direct determination of target and non-target compounds in foods without using standard reference. Compared with ultraviolet spectrophotometry, it had a higher specifi city.

quantitative nuclear magnetic resonance (QNMR); cheeses; conjugated linoleic acid (CLA); quantitation

TS201.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510027

2014-09-15

首都食品安全科技創優培育專項(Z141100002614013)；北京市優秀人才培養資助項目(20140000204400001)

李瑋(1984—),女,高級工程師,博士,研究方向為食品營養與安全。E-mail：liwei@bjmu.edu.cn