超聲波輔助復合酶提取菊糖工藝優化

范三紅，李 靜，王亞云，胡雅喃

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

超聲波輔助復合酶提取菊糖工藝優化

范三紅，李 靜，王亞云，胡雅喃

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

以菊芋塊莖為原料，采用超聲波輔助復合酶酶解法進行菊糖提取工藝研究。首先通過單因素試驗和Plackett-Burman篩選試驗確定菊糖提取工藝中影響顯著的3 個因素——超聲溫度、超聲時間和加酶量，再利用Box-Behnken試驗及響應面分析法優化最佳提取工藝條件。結果表明：最佳提取工藝條件為料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度51 ℃、加酶量120 ?g/g（m（果膠酶）∶m（纖維素酶）=1∶4）、超聲時間25 min、pH 5.5，優化后菊糖得率為72.2%。

超聲波；復合酶；菊糖；響應面

菊芋（Helianthus tuberosus L.）俗名洋姜、鬼子姜，屬多年生菊科向日葵屬，為食用地下塊莖的薯芋類蔬菜[1]。菊糖在菊芋中占有很大比例，它是一種聚合度2～60的混合物[2]。菊糖有很多功能性作用，如預防糖尿病人的低血糖以及促進腸道雙歧桿菌的生長，因此可以作為糖、脂肪替代物[3]而大量用于低熱量、低糖、低脂肪食品中，并能顯著改善無脂或低脂食品的口感[4]和質感,不僅如此，菊糖還具有促進礦物質吸收[5]和制備低聚果糖、超高純度果糖漿[6-7]等功能。研究[8-9]表明，每日攝食2 g菊糖對控制人體的質量、改善腸道功能、防止機體失調以及老年性疾病很有幫助。因此，菊糖已被世界上40多個國家批準為食品的營養增補劑。

目前，菊糖的提取主要采用熱水浸提法，該方法提取菊糖不僅提取率很低，而且耗時長，并且長時間的高溫加熱容易破壞菊芋中其他的活性成分。鑒于傳統的熱水浸提法存在的這些缺點，很有必要找到一種耗時少、操作方便且提取率高的實驗方法。采用超聲波輔助酶法提取菊糖，這種方法耗時短，而且超聲波的強烈振動以及空化效應可以使有效成分迅速進入溶劑，從而有利于菊糖的提取。本實驗在單因素試驗的基礎上，采用響應面優化菊糖的提取條件，從而為菊糖的工業生產提供理論依據[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊芋 山西省汾陽市品種；C8260-1纖維素酶R- 10（10 U/mg）、P8180-100果膠酶（40 U/mg） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TG16A-WS高速離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；奧立龍MODEL868酸度計、SP-2000UV型紫外分光光度計 上海光譜有限公司；AL204型電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；HH-4恒溫水浴鍋浙江國華電器公司；SP-040ST超聲波清洗機 廣州潔盟超聲波設備有限公司；XF50實驗室粉碎機 吉首市中誠制藥機械廠。

1.3 方法

1.3.1 可溶性總糖含量的測定

以葡萄糖為標準，采用蒽酮比色法在620 nm波長處測定吸光度，帶入葡萄糖標準曲線（回歸方程y=0.006 5x—0.035 7，R2=0.999 0），求出總糖質量，按式（1）計算菊芋中可溶性總糖含量[11]。

式中：C為在標準曲線中查出的糖含量/μg；V總為提取液的總體積/mL；V測為測定時取用液體體積/mL；D為稀釋倍數；M為樣品質量/g。

1.3.2 還原糖含量的測定

以葡萄糖為標準，采用3,5-二硝基水楊酸比色法在540 nm波長處測定吸光度，帶入葡萄糖標準曲線（回歸方程y=0.930 5x—0.038 73，R2=0.999 2），求出還原糖質量，按式（2）計算菊芋中還原糖含量[12]。

1.3.3 提取工藝流程

菊芋塊莖→切片→50 ℃烘干→粉碎→過80 目篩→樣品→超聲波輔助復合酶酶解→滅酶10 min→過濾→上清液（粗提液）

1.3.4 復合酶比例的篩選

準確稱取果膠酶和纖維素酶，使其質量比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，配制成0.1 mg/mL的復合酶酶解液，離心，取上清液放置4 ℃冰箱中備用。

分別稱取一定量的菊粉，加入2 mL上述配制好的復合酶酶解液，再加入等體積的蒸餾水，在超聲功率240 W、超聲溫度50 ℃的條件下超聲30 min，按式（3）計算菊糖得率。

1.3.5 菊糖粗提液提取的單因素試驗

采用控制變量法，分別研究料液比、pH值、超聲溫度、超聲時間、加酶量5 個因素對菊糖得率的影響[13]。

1.3.5.1 料液比對菊糖得率的影響

固定超聲功率240 W、超聲溫度40 ℃、pH 5.5、加酶量40 ?g/g，在料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）條件下超聲提取20 min，90℃滅酶10 min，過濾，測定上清液中總糖和還原糖的含量，計算上清液菊糖得率。

1.3.5.2 pH值對菊糖得率的影響

固定超聲溫度40 ℃、加酶量40 ?g/g、料液比1∶20（g/mL），pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5條件下超聲提取20 min，90 ℃滅酶10 min，過濾，計算上清液中菊糖得率。

1.3.5.3 超聲溫度對菊糖得率的影響

固定pH 5.5、加酶量40 ?g/g、料液比1∶20（g/mL），超聲溫度分別為35、40、45、50、55 ℃條件下超聲提取20 min，90 ℃滅酶10 min，過濾，計算上清液中菊糖得率。

1.3.5.4 聲時間對菊糖得率的影響

固定超聲溫度50 ℃、pH 5.5、加酶量40 ?g/g、料液比1∶20（g/mL），超聲時間分別為10、15、20、25、30 min條件下提取，90 ℃滅酶10 min，過濾，計算上清液中菊糖得率。

1.3.5.5 加酶量對菊糖得率的影響

固定超聲溫度50℃、pH 5.5、料液比1∶20（g/mL），加酶量分別為0、40、80、120、160 ?g/g條件下超聲提取25 min，90 ℃滅酶10 min，過濾，計算上清液中菊糖得率。

1.3.6 Plackett-Burman篩選試驗設計

在單因素基礎上，對五因素進行因素篩選試驗，確定顯著影響因素。

1.3.7 響應面試驗設計

在單因素試驗和Plackett-Burman篩選試驗的基礎上，對所確定的因素進行Box-Behnken試驗，確定最佳菊糖提取工藝參數。

2 結果與分析

2.1 復合酶比例的篩選

從圖1可以看出，當m（果膠酶）：m（纖維素酶）為1∶4時，菊糖得率最高。當其質量比為1∶5時，菊糖得率會減小。這是可能因為當纖維素酶質量濃度增加到一定程度時，使得酶活性降低，對纖維素的酶解能力減弱，導致菊糖得率降低[14]。所以選擇復合酶（果膠酶和纖維素酶）質量比為1∶4。

2.2 菊糖粗提液提取的單因素試驗結果

2.2.1 料液比對菊糖得率的影響

從圖2可以看出，料液比為1∶10（g/mL）時，菊糖得率最低，當料液比為1∶20時菊糖得率達到最高，之后隨著溶劑用量的增加，菊糖含量反而下降。因為隨著溶劑用量的增大，溶液中底物和酶的質量濃度也隨之下降，有效反應碰撞減少，所以最佳料液比為1∶20（g/mL）。

2.2.2 pH值對菊糖得率的影響從圖3可以看出，pH 5.5時，菊糖得率最高，因為pH 5.5可能是復合酶的最適pH值，當pH值增大后，改變了酶的空間構象[15]，從而使酶的活性下降。

2.2.3 超聲溫度對菊糖得率的影響

從圖4可以看出，隨著超聲溫度的升高，菊糖得率也隨著增大，在超聲溫度為50℃時，菊糖得率達到最大，當溫度進一步升高后，菊糖得率卻急劇下降。這是因為溫度升高，使復合酶失活，從而導致菊糖得率下降[16-17]。

2.2.4 超聲時間對菊糖得率的影響

從圖5可以看出，超聲時間為25 min時菊糖得率最高，超聲時間低于25 min時，菊糖含量隨著超聲時間的延長而增大，當大于25 min時，菊糖得率反而下降，可能因為多糖在較長超聲時間條件下遭到破壞[18]，分解成單糖。

2.2.5 加酶量對菊糖得率的影響

從圖6可以看出，菊糖得率隨著加酶量的增加而增大，當加酶量為120 ?g/g時，菊糖得率隨著加酶量增大而變得緩慢，可能因為此時酶的用量在底物質量濃度一定的情況下已經達到飽和，當酶用量增大時，菊糖得率變化很小，所以加酶量為120 ?g/g時為最佳。

2.3 Plackett-Burman試驗顯著影響因素的確定

2.3.1 試驗設計處理及響應值

在單因素試驗的基礎上，對5 個因素（料液比、超聲溫度、加酶量、pH值、超聲時間）利用Minitab15.0軟件進行Plackett-Burman試驗設計和數據分析，以菊糖得率為響應值，見表1。

2.3.2 關鍵影響因素的確定

利用Minitab 15.0軟件對試驗結果進行分析，得到回歸模型方差分析，見表2。

由表2可知，主效應的P=0.001＜0.05，決定系數R2=94.32%，說明試驗所得的擬合回歸方程達到顯著性（模型）；校正決定系數R2Adj=89.59%，表明89.59%的數據變異可以用此回歸方程來解釋，因此可以較好地確定關鍵影響因素。

由表3可知，因素X2、X3的P值小于0.01，說明這兩個因素對試驗具有極顯著的影響，因素X5的P值小于0.05，則說明其對試驗有顯著性影響，因此，在菊糖提取試驗中，顯著影響因素為超聲溫度、加酶量、超聲時間。故在下一步響應面分析中，重點考察超聲溫度、加酶量和超聲時間的最優水平范圍。

2.4 響應面試驗設計對最佳工藝條件的確定

2.4.1 Box-Behnken試驗設計與結果

利用Minitab 15.0軟件對菊芋中菊糖得率進行響應面設計，表4為響應面設計與結果，其中1～12為析因試驗，13～15為中心點重復試驗。

對表4中數據進行回歸分析，得到菊芋中菊糖得率對超聲溫度、加酶量、超聲時間的三元二次回歸方程為：

Y=—3.155 4X22—5.082 9X3

2—15.655 4X5

2+

1.325 0X2X3+4.432 5X2X5—1.365 0X3X5+1.553 8X2—0.640 0X3+0.953 7X5+72.553 3

由表5可知，本試驗所選的三元二次回歸模型具有較好的顯著性（P＜0.001），各因素對菊糖得率不是簡單的線性關系（P＞0.05），平方項和交互作用對該模型具有顯著性（P＜0.05），說明這兩項對響應值有極大的影響，決定系數R2=98.38%，校正決定系數=95.45%,說明該模型能解釋95.45%響應值的變化，從失擬項P=0.057＞0.05（不顯著），說明可以利用該回歸方程確定最佳菊糖的提取工藝。

從回歸系數顯著性分析（表6）可以看出，X22對菊糖得率的影響具有顯著性（P＜0.05），X32、X52、X2X5對菊糖得率的影響具有極顯著性（P＜0.01），說明在該試驗中，超聲溫度、加酶量、超聲時間對菊糖得率有顯著性影響，而從X22、X32、X52、X2X5也可以看出，它們對菊糖得率的影響是非線性的。

2.4.2 響應面分析與優化

根據上述二次多項回歸方程作出的響應面圖和等高線圖，可以直觀地看出超聲溫度，加酶量、超聲時間對菊糖得率的影響，如圖7～9所示。

從圖7可以看出，加酶量和超聲溫度的交互作用對菊糖得率影響不顯著，加酶量110～130 ?g/g、超聲溫度48～53 ℃時，菊糖得率有最高點。由圖8可以看出，超聲時間和超聲溫度的交互作用對菊糖得率影響顯著，超聲時間23～27 min、超聲溫度43～55 ℃時，菊糖得率有最高點。由圖9可以看出，加酶量與超聲時間的交互作用對菊糖得率影響也顯著，超聲時間22～28 min、加酶量100～140 ?g/g時，菊糖得率有最高點。

綜合圖7～9，三因素對菊糖得率的影響以及各因素的交互作用與回歸分析一致。利用Minitab15.0中的相應優化器可以得出菊糖得率最大時超聲溫度、加酶量、超聲時間的預測工藝，即超聲溫度51.46 ℃、加酶量118.79 μg/g、超聲時間25.35 min，菊糖最大得率預測值為72.82%。

2.4.3 超聲波輔助復合酶工藝條件的驗證及確定

驗證模型預測的準確性，考慮到操作可行性及方便性，將修正最佳提取條件為：超聲溫度51 ℃、加酶量120 ?g/g、超聲時間25 min。按此條件進行提取實驗，實驗重復3 次。得到的菊糖得率為72.2%、72.1%、72.2%，平均菊糖得率為72.2%，與預測值較接近，說明該模型能較好地預測超聲波輔助復合酶提取菊糖的實際提取效果，具有實際應用價值。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，通過Plackett-Burman篩選試驗、Box-Behnken試驗設計以及響應面分析法對菊糖的提取工藝進行了優化，確定了加酶量、超聲溫度、超聲時間為最佳菊糖提取的顯著影響因素，即最佳工藝條件為超聲溫度51 ℃、加酶量120 ?g/g、超聲時間25 min，在此條件下，菊糖得率為72.2%。

近年來，酶工程技術被廣泛應用于植物中活性物質的提取，因為植物細胞壁主要是由纖維素、果膠、半纖維素等組成，利用合適的酶，可以使提取條件溫和，不易破壞其他活性成分。所以本實驗主要采用纖維素酶和果膠酶破壞細胞壁成分，使糖類物質易于溶出，同時結合超聲波，利用超聲波的機械作用進而加速細胞壁的破裂，促進菊芋中菊糖的快速溶出，縮短了提取時間。超聲波輔助復合酶提取多糖的方法，在菊糖提取方面還沒有涉及，但在雙孢菇多糖[19]、半邊蓮多糖[20]的提取上已有了研究，與傳統方法[21]相比，該法在菊糖得率上分別提高了13.9%、70.6%，同時在提取時間與溫度上也有了明顯的縮短與降低。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Inulin by Response Surface Methodology

FAN Sanhong, LI Jing, WANG Yayun, HU Ya’nan
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Inulin was ultrasonically extracted from jerusalem artichoke tubers by enzymatic hydrolysis with both pectinase and cellulase. By using single factor and Plackett-Burman designs, temperature, ultrasonication time and enzyme dosage were found to be significant factors influencing the extraction process. The three factors were further optimized by response surface methodology with Box-Behnken design. The results showed that the optimal extraction conditions were determined as a material-to-liquid ratio of 1:20 (g/mL), an extraction temperature of 51 ℃, a total enzyme dosage of 120 ?g/g with m (pectinase):m (cellulase) ratio = 1:4, an ultrasonic treatment time of 25 min, and a pH of 5.5. Experiments conducted under these conditions gave an inulin yield of 72.2%.

ultrasonic treatment; complex enzyme; inulin; response surface methodology

TS218

A

1002-6630（2015）04-0023-06

10.7506/spkx1002-6630-201504005

2014-07-01

山西省自然科學基金項目（2012011031-4）；山西省高等學校高新技術產業化項目（20111003）

范三紅（1963—），男，副教授，碩士，研究方向為食品科學。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn