FOXP3及ROR-γ轉錄因子在非重型再生障礙性貧血的意義及與腎虛證的相關性

胡明輝，胡令彥，周永明，陳海琳

(上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海200437)

·學術探討·

FOXP3及ROR-γ轉錄因子在非重型再生障礙性貧血的意義及與腎虛證的相關性

胡明輝，胡令彥，周永明，陳海琳

(上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海200437)

目的 研究FOXP3、ROR-γ轉錄因子在非重型再生障礙性貧血(NSAA)中的意義及與腎虛分型的相關性。 方法 收集CAA患者102例，用RT-PCR方法檢測FOXP3及ROR-γ轉錄因子水平，與正常對照組比較。 結果 與正常對照組比較，FOXP3mRNA、ROR-γtmRNA表達水平高于正常對照組； ROR-γt mRNA在腎虛組間比較有差異，腎陰虛組>腎陽虛組>腎陰陽兩虛組(P<0.05)；ROR-γt mRNA與腎虛分型有相關性，P<0.01。 結論 FOXP3、ROR-γ轉錄因子與NSAA發病有一定相關性，主要異常發生在ROR-γ轉錄因子之間的調控，中醫腎虛分型與轉錄因子有相關性。

非重型再生障礙性貧血； FOXP3轉錄因子； ROR-γ轉錄因子； 腎虛證

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是由各種原因引起的骨髓造血功能的衰竭，其特征為全血細胞減少。T細胞介導的細胞免疫是AA重要發病機制，AA患者活化狀態T細胞的增加是其免疫病理機制的生物學基礎[1]。近年新發現Th17/CD4+CD25+Treg失衡在再障免疫發病過程中的地位日益顯著[2]，而其失衡的表現并不能單以Th17及Treg細胞水平來表達，其對免疫紊亂的作用較大程度取決于其轉錄因子水平的變化。我們就Th17及Treg細胞的相關轉錄因子FOXP3及ROR-γ在NSAA中的影響作一研究，并分析其與中醫腎虛分型的相關性。

1 臨床資料

1.1 病例選擇標準

1.1.1 西醫診斷標準[3]① 血常規檢查：全血細胞減少，校正后的網織紅細胞比例

1.1.2 AA分型 重型AA診斷標準(Camitta標準)：① 骨髓細胞增生程度<正常的25%；如≥正常的25%但<50%，則殘存的造血細胞應<30%。② 血常規：需具備下列3項中的2項：ANC<0.5×109/L；校正的網織紅細胞<1%或絕對值<20×109/L；BPC<20×109/L。③ 若ANC<0.2×109/L為極重型AA。非重型AA診斷標準(NSAA)：未達到重型標準的AA。

1.1.3 中醫證候分型標準 按照1989年6月在大連召開的中國中西醫結合研究會血液病專業委員會第三屆第二次學術座談會制訂的辨證分型標準。① 腎陰虛證：主癥：心悸，頭暈，周身乏力，面色口唇指甲蒼白，盜汗，出血，次癥：低熱，手足心熱，口渴思飲，大便干結，舌質淡或舌尖紅，苔薄，脈細數。② 腎陽虛證：主癥：心悸，頭暈，周身乏力，面色口唇指甲蒼白，形寒肢冷，腰膝酸軟。次癥：性功能減退，大便溏，多無出血或出血輕微，舌質淡，脈沉細或虛大。③ 腎陰陽兩虛證：除有血虛證侯外，兼有以上腎陰虛及腎陽虛證候。

1.2 一般資料 選擇上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院2011年3月-2013年3月的門診和住院NSAA者102例，辨證分為腎陰虛型、腎陽虛型、腎陰陽兩虛3組，見表1。

2 方法

2.1 實驗方法 FOXP3、ROR-γ轉錄因子采用實時熒光定量PCR法檢測，由上海博彩生物公司提供的引物DEPC、NTP。分離外周血單個核細胞(BMMNC)，進行總RNA的提取，對所提取RNA進行鑒定。TRIzol抽提細胞總RNA，按說明書進行反轉錄，逆轉錄合成cDNA，逆轉錄反應產物保存于-20°冰箱備用。PCR引物由上海生物工程技術服務有限公司設計合成。PCR擴增后產物在瓊脂糖凝膠上110V電壓條件下電泳45min，溴化乙錠染色，數碼凝膠圖像分析系統作條帶密度掃描，結果以bcl-6與內參照的灰度比值表示。

表1 3組一般情況

3 結 果

實驗結果 見表2、表3。

表2 2組FOXP3mRNA、ROR-γtmRNA水平比較

注：與正常組比較，1)P<0.05。

表3 3組FOXP3mRNA，ROR-γtmRNA水平比較

注：與腎陰虛組比較，1)P<0.05。

3.2 ROR-γt mRNA 與FOXP3 mRNA比值 Th17與Treg的特異性轉錄因子ROR-γt mRNA 與FOXP3 mRNA在NSAA患者中均有升高，但二者比值NSAA組ROR-γt mRNA/FOXP3 mRNA較正常組明顯升高。

3.3 腎虛分型與轉錄因子相關性 為探索NSAA腎虛分型與轉錄因子相關性，行Spearman相關性分析，結果提示ROR-γt mRNA與腎虛分型有相關性，r=-0.286，P<0.01。FOXP3 mRNA轉錄因子與腎虛分型無相關性。

4 討 論

4.1 Th17/Treg免疫失衡與NSAA免疫發病關系被很多研究所證實。Treg的免疫表型為表達細胞內轉錄因子FOXP3，有研究證實AA患者胞內轉錄因子FOXP3表達也明顯下調[4]。但Th17細胞分化與CD4+CD25+Treg細胞誘導存在相互排斥的關系，孤兒核受體ROR-γt是Th17細胞系特異的轉錄因子，當較高濃度的IL-6存在時，可誘導轉錄因子ROR-γt表達，使初始CD4+T細胞分化為Th17

細胞[5]。本課題組[6]已證實Thl7與Treg細胞比例和正常對照組比較差異有統計學意義，Treg細胞低于對照組，Thl7細胞高于對照組，Thl7/Treg水平明顯高于正常人。Fujisawa 等[7]研究結果表明造血干細胞RORγt表達上調，可以誘導Th17細胞分化，但能同時增加Treg細胞數量。結果的矛盾促使我們從轉錄因子層面去進一步探討其作用機制。本試驗結果顯示，轉錄因子FOXP3mRNA、ROR-γtmRNA表達水平顯著高于正常對照組，NSAA組ROR-γt mRNA/FOXP3 mRNA較正常組明顯升高，使得最終導致Th17/Treg的升高，從而發生Th17/Treg免疫紊亂的狀態。

4.2 在與中醫腎虛相關性的研究結果顯示ROR-γtmRNA在腎虛組間比較有差異，腎陰虛組>腎陽虛組>腎陰陽兩虛組，這與既往研究中腎陰虛Th17細胞比例升高有關聯，提示腎陰虛在Th17細胞比例升高方面的特征存在。Th17/Treg相關轉錄因子在不同腎虛分型中的差異主要存在ROR-γtmRNA中。中醫理論認為“邪之所湊，其氣必虛”，雖然再障以腎虛為本，但發病之初或發病過程中，風邪、濕熱等邪毒是作為疾病發生、發展、惡化環節中的重要因素，我們認為Th17及其相關轉錄因子、細胞因子的紊亂或過度表達而發生的免疫亢進與NSAA患者發病過程中在正虛基礎上發生邪毒侵犯，導致疾病發生有高度相關性。

[1]YOUNG NS，BACIGALUPO A，MARSH JC． Aplastic anemia：pathophysiology and treatment[J]． Biol Blood Marrow Transplant，2010，16：119-125．

[2]王寧玲，王敏，王會平，等.再生障礙性貧血患兒外周血Treg/Th17細胞失衡的研究[J].中國小兒血液與腫瘤雜志，2014，19(4)：202-205.

[3]中華醫學會血液學分會紅細胞疾病學組． 再生障礙性貧血診斷治療專家共識[J].中華血液學雜志，2010，31(11)：790-792.

[4]SHEVACH E M． CD4CD25suppressUrT cells：More questions than aIl-swels[J]． Nat Rev hnmunol，2002,2(6)：389-400．

[5]YANG XO，PAPPU BP，NURIEVA R，et al.T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear trceptors ROR alpha and ROR gamma[J]. Immunity，2008,28(1)：29-39.

[6]胡令彥，周永明，陳英坤，等. 非重型再生障礙性貧血患者Thl7/Treg比例及相關細胞因子白細胞介素-6、-17和轉化生長因子β1水平的臨床意義[J]. 臨床內科雜志，2013，30(9)：636-639.

[7]FUJISAWA Y，NABEKURA T，KAWACHI Y，et al． Enforced ROR-γ expression in haematopoietic stem cells increases regulatory T cell number，which reduces immunoreactivity and attenuates hypersensitivity in vivo[J].Asian Pac J Allergy Immunol，2011,29(1)：86-93.

2014-10-25

國家自然科學基金資助課題(81001510)

胡明輝(1975-)，女，醫學博士，副主任醫師，主要從事中醫藥治療血液病的研究。

R556

A

1000-338X(2015)03-0001-02