澤瀉滴丸的質量控制標準

溫秀萍，許 文，，李小艷，洪海棉，，丘建芳，趙萬里，黃鳴清，宋 煜，吳水生

(1.福建中醫(yī)藥大學生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建福州350122； 2.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州350122)

·方與藥·

澤瀉滴丸的質量控制標準

溫秀萍1，許 文1，2，李小艷2，洪海棉1，2，丘建芳2，趙萬里2，黃鳴清2，宋 煜2，吳水生2

(1.福建中醫(yī)藥大學生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建福州350122； 2.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州350122)

目的 建立澤瀉滴丸的質量標準。方法 用薄層色譜法對澤瀉滴丸進行定性鑒別，用紫外-可見分光光度法測定澤瀉滴丸總三萜含量，用高效液相色譜法，Ultimate XB-C18色譜柱：4.6 mm×150 mm，5 μm；流動相：乙腈-水(65∶35)；流速：1 mL/min；檢測波長：208 nm，測定23-乙酰澤瀉醇B的含量。 結果 薄層色譜圖中可以檢出澤瀉的特征斑點，UV-Vis法含量測定，香草醛-高氯酸顯色，總三萜以23-乙酰澤瀉醇B計，濃度在5.97～15.92 μg/mL與吸光度值呈良好線性關系，平均加樣回收率97.08%，RSD 3.75%，HPLC法測定23-乙酰澤瀉醇B的濃度在9.88～59.28 μg/mL，與峰面積呈良好線性關系、平均加樣回收率98.04%，RSD 2.20%。 結論 薄層色譜法、UV-Vis法、HPLC法簡便，準確，專屬性強，重復性好，可有效控制澤瀉滴丸的質量。

澤瀉滴丸；薄層色譜；紫外-可見分光光度法；高效液相色譜法；23-乙酰澤瀉醇B

從上世紀60年代至今，國內外學者從澤瀉中分離得到的化學成分有近百種，以原萜烷型四環(huán)三萜類成分為主要成分[1]。現(xiàn)代藥理學研究表明，澤瀉中三萜類化合物是其降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗脂肪肝、降糖的主要藥效成分[2-5]，含量較高的三萜成分23-乙酰澤瀉醇B，被中國藥典、日本藥典收載作為澤瀉藥材含量測定的指標。我們課題組前期已經考察了澤瀉總三萜提取物制劑澤瀉滴丸成型工藝[6]及加速穩(wěn)定性[7]，澤瀉滴丸藥效學研究表明澤瀉滴丸具有抗炎、利尿、降血脂、抗脂肪肝功效，長期毒性試驗、急性毒性試驗、一般藥理學研究表明澤瀉滴丸安全無明顯毒副作用[8]。為了澤瀉滴丸應用的安全有效，我們研究澤瀉滴丸的質量標準，為其質量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV9100紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)；DV-2150CD型十萬分之一分析天平(美國奧豪斯公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；Goodsee-II型薄層色譜攝影儀(上海科哲生化科技有限公司)；色譜乙腈(德國默克公司)；其它所用試劑均為分析純。澤瀉滴丸(福建中醫(yī)藥大學藥學院自制，批號：中試2011001、中試2011002、中試2011003)；23-乙酰澤瀉醇B對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111846-201102)。

2 方法與結果

2.1 性狀 本品為棕色到棕黑色滴丸，氣微香，味苦。

2.2 薄層鑒別 取本品0.1 g，加乙腈1 mL，超聲處理20 min，0.45 μm濾膜濾過，濾液加于氧化鋁柱(200～300 目，5 g，內徑1 cm，干法裝柱)上，用乙酸乙酯10 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使之溶解，作為供試品溶液。取23-乙酰澤瀉醇B對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，移取上述2種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯(1∶1)，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，105 ℃加熱顯色至斑點顯色清晰。供試品色譜中，于對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾。3批中試澤瀉滴丸薄層鑒別結果見圖1。斑點1、2、3為澤瀉滴丸，4為對照品23-乙酰澤瀉醇B，5為陰性空白滴丸。

注：A.中試2011001；B.中試2011002；C.中試2011003。

2.3 總三萜含量測定

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱取澤瀉滴丸60 mg，置25 mL瓶中，加適量乙腈超聲溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對照品5 mg，加乙腈25 mL制成每1 mL含0.2 mg對照品溶液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液制備 精密稱取澤瀉陰性滴丸(聚乙二醇輔料做成的滴丸)60 mg，置25 mL瓶中，加適量乙腈超聲溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。2.3.4 測定波長選擇 分別精密移取對照品、供試品、陰性溶液各200 μL于3個5 mL瓶中，水浴揮干，精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL、高氯酸0.8 mL，混勻，密塞，置60 ℃水浴中加熱15 min，取出，冰浴5 min停止反應，取出放至室溫，用冰醋酸定容至刻度，混勻。三者分別以同法處理的空白顯色體系為參比，在410～800 nm波長處掃描。結果對照品與供試品紫外吸收基本一致，最大吸收波長在555 nm，陰性樣品在波長400～800 nm處無吸收，在555 nm處不干擾測定總三萜含量，故選擇555 nm為比色測定波長。

2.3.5 顯色條件考察 顯色的溫度、高氯酸量、5%香草醛量、顯色時間對顯色反應有影響。香草醛量和反應時間對顯色影響不大，溫度和高氯酸量對顯色影響較大。溫度越高，吸光度值越大，高氯酸量越大，吸光度值也越大。經過優(yōu)化最終選擇顯色條件為：60 ℃、高氯酸0.8 mL、5%香草醛0.2 mL、顯色時間15 min。

2.3.6 方法學考察

2.3.6.1 標準曲線繪制 分別精密移取對照品溶液150、200、250、300、350、400 μL加入6個5 mL瓶中，水浴60 ℃揮干溶劑，按2.3.5項顯色，以同法處理的空白顯色體系為參比，在555 nm波長處測吸光度，以吸光度對濃度進行回歸計算，得回歸方程：

Y = 0.0496 X - 0.0408 r=0.999 2

表明23-乙酰澤瀉醇B的濃度在5.97～15.92 μg/mL與吸光度值呈線性關系。

2.3.6.2 精密度實驗 精密量取對照品溶液和供試品溶液各200 μL于5 mL瓶中，60 ℃水浴空氣吹干溶劑，按2.3.5項顯色后在紫外分光光度計上連續(xù)測定6次，結果對照品溶液和供試品溶液RSD為0.17%、0.25%。

2.3.6.3 穩(wěn)定性實驗 精密量取對照品溶液和供試品溶液各200 μL于5 mL瓶中，按2.3.5項顯色后，在120 min室溫下每隔5 min測定吸光度1次。結果表明供試品和對照品顯色產物在室溫下90 min內穩(wěn)定，RSD為2.14%、2.73%。

2.3.6.4 重復性實驗 精密稱取同批(批號：中試2011001)澤瀉滴丸6份，按2.3.1項制成供試品溶液，按2.3.5項顯色后測定吸收度并根據(jù)標準曲線計算，結果該批滴丸總三萜百分含量平均值為12.07%，RSD 2.05%，說明重復性良好。

2.3.6.5 中間精密度試驗 分別由A、B、C 3人，分別取同批供試品3份，在不同的時間，用同一臺設備測定，A、B、C 3人測定結果為11.98%、12.04%、12.09%，RSD為1.85%、1.92%、2.67%，結果表明中間精密度良好。

2.3.6.6 加樣回收實驗 精密稱取同一批次已知含量的澤瀉滴丸(重復性實驗批次)30 mg，共6份，另取23-乙酰澤瀉醇B對照品，按對照品∶樣品中總三萜1∶1加入按2.3.1項制備供試品溶液，按2.3.5項顯色后測定，結果見表1。

表1 加樣回收率實驗

2.3.7 3批中試澤瀉滴丸含量測定 精密稱取3批中試澤瀉滴丸各60 mg，按2.3.1項制備供試品并按2.3.5項顯色，以相應的空白試劑為參比，測定吸光度，并計算滴丸總三萜百分含量。結果3批澤瀉滴丸含總三萜為12.09%、11.97%、12.08%，RSD為0.48%、1.11%、0.30%。

2.4 23-乙酰澤瀉醇B含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 精密稱取澤瀉滴丸20 mg，置25 mL瓶中，加入乙腈適量，超聲處理使之溶解，取出，放冷，加乙腈至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。陰性樣品同法制備。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對照品12.35 mg，置于25 mL瓶中，加乙腈稀釋至刻度，制成每1 mL含494 μg的溶液，即得。

2.4.3 色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱：4.6mm×150mm，5 μm；流動相：乙腈-水(65∶85)；檢測波長：208 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃。色譜圖見圖2～圖4。

圖2 對照品HPLC色譜圖

圖3 供試品HPLC色譜圖

圖4 陰性樣品HPLC色譜圖

2.4.4 方法學驗證

2.4.4.1 線性范圍 取23-乙酰澤瀉醇B母液，用乙腈稀釋成9.88、19.76、29.64、39.52、59.28 μg/mL梯度濃度標準溶液，分別進樣10 μL分析，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制23-乙酰澤瀉醇B標準曲線，得線性方程：

Y = 9982 X + 2452 r=0.9999

線性范圍9.88～59.28 μg/mL。

2.4.4.2 精密度實驗 取同份23-乙酰澤瀉醇B對照品連續(xù)進樣6次，計算峰面積RSD為0.78%，說明精密度良好。

2.4.4.3 穩(wěn)定性實驗 取同份樣品分別于0、2、4、8、24 h進行測定，記錄標準品的峰面積，計算RSD為3.67%，結果表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.4.4.4 重復性實驗 精密稱取同一批次滴丸樣品6份，制備樣品，進樣分析，根據(jù)標準曲線計算百分含量，該批滴丸中23-乙酰澤瀉醇B平均百分含量為2.004%，RSD為2.58%，結果表明重復性良好。

2.4.4.5 中間精密度試驗 由A、B、C 3人，分別取同批供試品3份，在不同的時間，用同一臺設備，按含量測定方法測定，A、B、C 3人測定結果分別為1.998%、1.994%、2.002%，RSD為1.55%、0.93%、1.27%，結果表明中間精密度良好。

2.4.4.6 加樣回收實驗 精密稱取同一批次已知含量的澤瀉滴丸(重復性實驗批次)10 mg，共6份，另取23-乙酰澤瀉醇B對照品，按對照品：樣品中23-乙酰澤瀉醇B量1∶1加入，制備供試品溶液，分別測定，結果見表2。

表2 加樣回收率實驗

2.4.5 3批中試樣品含量測定 精密稱取3批中試澤瀉滴丸各20 mg，分別制備供試品并測定。根據(jù)標準曲線計算滴丸23-乙酰澤瀉醇B百分含量，3批中試滴丸含量測定結果表明三批澤瀉滴丸含23-乙酰澤瀉醇B含量分別為2.053%、1.998%、2.185%，RSD為2.74%、2.27%、2.03%。

3 討 論

3.1 本實驗薄層鑒別參考2010版藥典澤瀉藥材方法，比較了樣品制備、展開劑、顯色劑、點樣量、硅膠類型，最終選擇與藥典一致的樣品制備方法及展開劑，但是顯色劑比較5%硅鎢酸乙醇、5%香草醛-硫酸、10%硫酸-乙醇溶液后發(fā)現(xiàn)，10%硫酸乙醇顯色優(yōu)于藥典的5%硅鎢酸乙醇，最終選擇10%硫酸乙醇顯色。

3.2 本實驗建立UV-Vis法測定澤瀉滴丸中總三萜含量方法，經線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復性、回收率考察，結果符合分析要求。3批中試澤瀉滴丸的總三萜含量為12.09%、11.47%、12.98%，平均含量為12.18%，以中試實際保留率的80%計算，本品中總三萜含量限度暫定為每g滴丸中含總三萜量以23-乙酰澤瀉醇B計不低于97.4 mg。

3.3 本實驗建立的高效液相色譜法測定澤瀉滴丸中23-乙酰澤瀉醇B含量，方法經線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復性、回收率考察，符合分析要求。3批中試澤瀉滴丸的含量為2.053%、1.998%、2.185%，平均含量為2.078%，以中試實際保留率的80%計算，本品中23-乙酰澤瀉醇B含量限度暫定為每1 g滴丸不低于16.6 mg。本實驗建立澤瀉滴丸質量標準性狀、鑒別、含量測定，方法快速、簡便，可為澤瀉滴丸的質量控制提供實驗依據(jù)。

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2014-09-12

國家自然科學基金資助課題(1205022)；國家“十二五”科技支撐計劃資助課題(2011BAI01B06)；福建省自然科學基金資助課題(2014J01352)；福建省衛(wèi)生廳青年科研資助課題(2013-2-55)；福建中醫(yī)藥大學校管課題(X2012023)

溫秀萍(1984—)，女，研究實習員，主要從事藥用植物種質資源研究。

R917

A

1000-338X(2015)03-0031-03