胚胎植入前遺傳學篩查技術的應用進展

岳佳，李永剛

（1.昆明理工大學醫學院，昆明 650032；2.云南省第一人民醫院生殖遺傳一科，昆明 650032）

一、胚胎植入前遺傳學篩查（PGS）的定義及適應癥

1990年，Handyside等［1］對1例性連鎖遺傳病夫婦的胚胎，應用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增Y 染色體特異位點后成功對植入前的胚胎進行了遺傳學診斷，誕生一例健康女嬰。該技術被定義為胚胎植入前遺傳學診斷（PGD），即針對具有遺傳病患病風險的夫妻，在體外受精（IVF）后取出胚胎6～8細胞時期的一個卵裂球進行遺傳學分析，以期獲得不受遺傳缺陷影響的胎兒。起初只有PCR 應用于PGD，但隨著熒光原位雜交（FISH）技術的引入，也可對染色體拷貝數異常進行檢測。1993年，Munne等［2］首先提出對胚胎進行非整倍體的PGD，他們活檢出人卵裂期胚胎的一個細胞，用多色FISH 探針對其進行非整倍體篩查。1995年，報道了第一例通過非整倍體篩查后進行胚胎移植而分娩的活嬰。在IVF中，染色體數目異常的胚胎移植后會導致胚胎不能發育至足月，從而致使某些特殊不孕患者的活產率降低。因此，以期通過活檢卵裂期的一個細胞，并應用FISH 技術進行染色體異常拷貝數的篩查來改善IVF的妊娠結局。該方法被定義為胚胎植入前遺傳學篩查（PGS）。

眾所周知，高齡女性的生育力降低大多與卵子的非整倍性相關。臨床研究表明，隨著女性年齡的增大，尤其是35歲后，卵子出現非整倍體的概率顯著增加。這也從一定程度上解釋了高齡女性無論在自然受孕還是IVF中妊娠率降低的原因。因此，從PGS的應用目的來看，高齡女性被認為是PGS最大的受益者。此外，PGS也適用于反復種植失敗、復發性流產、男性因素導致的不孕、女性本身攜帶三體的染色體以及卵子捐贈等，因為在這些女性中也發現了高發的胚胎非整倍體［3］。近來，在年輕女性中也發現存在高發的胚胎非整倍體，Franasiak等［4］的研究表明，年齡在26歲以下的女性也有較高的胚胎非整倍性風險，因此PGS也被用于年輕女性的非整倍體篩查。對于預后良好的年輕女性，通過PGS策略選擇優質的胚胎進行單胚胎移植（SET）能夠降低醫源性多胚帶來的風險［5］。

二、PGS的應用近況

當前，根據歐洲生殖和胚胎協會（ESHRE）PGD小組的數據，植入前遺傳學非整倍體篩查在歐美發達國家的輔助生育領域中已逐漸大量使用。ESHRE收集的多中心數據表明1997～1998年，全球的生殖中心僅進行了116個PGS周期，而2006年，全球57個生殖中心共進行了3 900個PGS周期［6］。但根據2009年的統計數據發現，全球60個生殖中心僅進行了3551 個PGS 周期，有略微下降的趨勢［7］。

從理論上來說，選擇染色體數目正常的胚胎移植可以提高種植率和妊娠率，降低流產率，提高活產率，但實際情況可能并非如此，近些年來關于PGS的爭論從未停止過，且大有愈演愈烈之勢。Munne和Cohen贊成對符合PGS 指征的患者實行PGS。Munne等［8］對高齡婦女行PGS 的研究表明，盡管PGS沒有提高胚胎種植率，但提高了妊娠率和活產率。Gianaroli等［9］的研究表明實行PGS的高齡婦女，每個移植周期的種植率和妊娠率都有提高。PGS也能顯著降低高齡婦女的流產率。而荷蘭學者Mastenbroek等［10］通過一個大樣本、多中心、隨機雙盲的研究，發現408 名年齡35～41 歲的IVF婦女中，進行PGS（取單卵裂球活檢）反而明顯降低了活產率，而與流產率無關。在實驗組，60%的胚胎被檢查出為非整倍體，提示在對照組中可能也有相似的非整倍體率。小部分嵌合型胚胎可以在發育后期自我糾正，但多數以流產告終，兩組的臨床流產率相似而實驗組的活產率明顯降低，說明PGS對于高齡婦女只是干擾了胚胎的自然選擇，對妊娠結局并無益處。最近的一項對PGS研究的Meta分析也表明行PGS會顯著降低高齡婦女的活產率［11］。關于PGS在IVF中的負面影響，一些學者認為實驗設計以及方案存在缺陷和技術水平低下等問題是潛在的一個重要因素［12］。

三、PGS中活檢方法的應用

1.極體活檢：極體是卵母細胞經過兩次減數分裂排出的具有與其相對應染色體組的單倍體細胞，不構成胚胎發育的部分，因此認為通過極體活檢可以間接預測胚胎的非整倍性［3］。此外，在胚胎活檢被法律禁止的國家，例如德國、奧地利、瑞士和意大利，極體活檢是主要應用的方法［13］。其優勢還在于受精卵期尚未出現嵌合體，因此可以避免胚胎嵌合體導致的誤診，并且可以提供充足的時間進行遺傳學分析。關于極體活檢后的妊娠率和活產率早已有報道。ESHRE 的PGS 小組初步擬定了通過極體活檢來對高齡女性胚胎非整倍體進行篩查的方案，并在實驗中發現極體的非整倍性和胚胎是相近的，吻合率達到94%［14］。Christopikou等［15］通過對高齡女性D3期胚胎進行極體活檢和檢測后也發現，其對于預測胚胎的非整倍體準確率高達98%。因此提示，通過對卵裂期胚胎的極體進行活檢對于PGS是有效的。但最近，Salvaggio等［16］的一項研究表明，采用極體活檢對預測胚胎的非整倍性價值不大，并沒有達到預期的臨床效果。作者認為，其中一個重要的原因是極體活檢本身的局限性，即只能檢測母源性因素導致的非整倍體，而男性因素及受精前的環境因素也能導致約10%的胚胎非整倍體。此外，有研究認為在受精過程中兩個極體的存在可能與胚胎的定向發育相關聯［17］。過早地進行極體活檢可能會擾亂胚胎的定向分化，并在胚胎發育的晚期產生負面影響。

2.卵裂期活檢：卵裂期活檢是通過取胚胎發育至D3期的單個或兩個卵裂球進行活檢。該活檢方法普遍應用于PGS，統計顯示，約90%的PGS周期中應用了卵裂球活檢技術［18］。但目前的一項meta分析表明卵裂球活檢并不能改善PGS的妊娠結局，其中一個重要的原因是卵裂期胚胎中大量嵌合體的存在有可能導致誤診，產生假陰性或假陽性結果［11］。胚胎未分化前，約有65%～70%的胚胎存在嵌合體［19］。此外，胚胎活檢損傷、技術操作失誤及遺傳分析方法的局限性等技術缺陷都有可能導致PGS的誤診［11］。因此，越來越多的研究傾向于應用囊胚期活檢代替卵裂期活檢。

3.囊胚期活檢：囊胚活檢已迅速成為一種更優的方法應用于非整倍體的篩查。澳大利亞的一家私人生殖中心首先采用了該方法，他們取胚胎滋養外胚層的細胞進行檢測并獲得了一例健康的嬰兒。相對于極體活檢和卵裂期活檢，囊胚期活檢可獲取更多的細胞進行遺傳學分析，可進行重復檢測。此外，由于胚胎在囊胚期含有非整倍體的風險（38.8%）小于卵裂期（51%），因此采用囊胚期活檢能夠降低誤診率［20］。這可能是由于D2／D3期的嵌合體胚胎含有大量的非整倍體細胞，并且這些胚胎不能發育至囊胚期（由于部分非整倍體胚胎被自然淘汰）。如果胚胎中僅含有中等或低水平的嵌合體，那么當其發育至囊胚期時會進行“修復”，以致大部分胚胎獲得正常的染色體型。Fragouli等［21］在研究中發現只有約1／3的囊胚存在嵌合體。Scott［22］在一項前瞻性隨機對照實驗中對囊胚期的胚胎進行了24條染色體的非整倍體篩查分析，并進行了新鮮胚胎的移植，結果表明該實驗組的臨床妊娠率為92%（12／13），高于對照組的臨床妊娠率60%（9／15）。近年來，大量的研究數據表明，相比于卵裂期活檢，囊胚活檢更能改善PGS的妊娠結局。但目前存在的爭議認為，對于高齡女性以及卵巢早衰的年輕女性，能發育至囊胚期的胚胎數量急劇減少，這就在一定程度上降低了植入率，并且有研究表明通過D3 期移植也能獲得正常的妊娠［23］。

四、PGS中診斷技術的應用

1.熒光原位雜交技術：熒光原位雜交技術（FISH）作為一種較早應用于胚胎植入前遺傳學篩查的技術，現已發展成熟。常規的FISH 技術可對5～14對染色體進行非整倍體篩查［24］。作為第一代PGS技術（PGS＃1）［25］，即主要應用D3 期活檢結合FISH 檢測，已經表明對改善IVF的妊娠結局沒有益處［11］。FISH 只能在同一時間對少數染色體進行檢測的局限性是導致不能改善PGS妊娠結局的一個重要原因。此外，沒有實驗數據證明何種探針組合是最有效的。事實上，探針的選擇具有很大的隨機性，并且沒有大量關于卵裂期胚胎23條染色體出現非整倍體頻率的實驗數據。在FISH 中每個探針的檢出率為92%～99%，因此在多探針的聯合應用中，其誤診率是顯而易見的［26］。假設每個探針的檢出率為98%，那么8種探針的組合其錯誤率達到15%。該檢測方法存在較低的陽性預測值，這會導致很多有發育潛能的胚胎被錯誤排除，進而影響到PGS的效能。卵裂期存在大量的嵌合體也是導致FISH 誤診風險增加的一個因素。FISH 檢測過程中涉及的細胞固定和信號重疊，是導致PGS診斷錯誤的因素，錯誤率在40%～50%［27］。由于FISH技術中存在的固有缺陷，因此逐漸被新發展的檢測技術所替代。

2.比較基因組雜交技術（CGH）：CGH 在PGS中的應用從染色體檢測數目上彌補了FISH 的不足。CGH 能夠對24條染色體進行檢測，結合卵裂期活檢，是最早應用于PGS 的染色體綜合分析技術。采用CGH 和FISH 技術分別對D3 期胚胎中同一時間段取出的兩個卵裂球進行檢測，其結果證實了CGH 的可靠性，并且應用CGH 可將非整倍體胚胎的檢測率從30%提高至33%［28］。但CGH 需要的檢測分析時間較長（4d），超過了新鮮胚胎移植的時間（1～2d），因此需要進行胚胎凍存，而早期的凍存技術使胚胎的存活率降低，因此限制了CGH在PGS中的應用。隨著玻璃化凍存（Vitrification）技術的發展，CGH 逐漸應用于極體活檢和囊胚活檢。Fragouli等［29］應用CGH 對極體和囊胚活檢后得到的妊娠率分別為21%和69.2%，提示CGH 結合囊胚活檢可以改善IVF 的妊娠結局。基于微陣列技術平臺的檢測技術使PGS不僅能夠對24條染色體的非整倍性進行檢測，并且縮短了檢測時間，自動化的結果判定更加客觀準確。目前，微陣列比較基因組雜交技術（aCGH）就是一種基于微陣列檢測技術的比較基因組雜交技術。與FISH 相比較，aCGH 無需進行細胞固定，并且能在同一時間對全染 色 體 組 進 行 檢 測。Gutierrez-Mateo 等［30］對aCGH 的有效性進行了研究，結果表明aCGH 比12種探針聯合FISH 多檢測出42%的異常染色體及13%的異常胚胎。而Scott等［31］進行的一項前瞻性隨機雙盲臨床實驗提到aCGH 能夠將誤診率降低至4%，并且能夠提高種植率和分娩率。ESHRE PGS小組對aCGH 結合極體活檢的初期臨床實驗也表明了aCGH 在檢測合子非整倍性上的準確性［14］。此外，Fiorentino等［32］的臨床研究中也報道了應用aCGH 進行非整倍體篩查能得到70%的妊娠率。但aCGH 不能直接對單倍體和一些多倍體進行檢測，全基因組擴增中存在的等位基因脫扣和擴增偏倚現象可能會在一定程度上降低檢測效率。盡管如此，基于其較高的準確性和分辨率，aCGH 成為PGS＃2（第二代PGS）［25］主要的應用技術。但大量的實驗數據證明，胚胎嵌合體的存在依然使部分具有發育潛能的胚胎被排除［14，31］，未來還需要進行一系列aCGH 結合各活檢時期的隨機臨床實驗來證實其有效性。

3.單核苷酸多態微陣列技術（SNP array）：SNP array是另一項有前景的微陣列檢測技術，該技術能對24條染色體進行綜合分析，其原理類似于aCGH。SNP微陣列技術不僅能夠檢測胚胎的非整倍性，還能對單基因缺失進行檢測，并且能夠提供基因型數據以生成每一個胚胎獨有的DNA 指紋。目前各實驗室還在對該項技術的實用性進行實驗驗證并已經獲得了可觀的結果［31］。Schoolcraft等［33］在一項臨床實驗中，應用SNPs結合囊胚活檢得到了73%的妊娠率。近期，Tobler等［34］比較了aCGH和SNP 在PGS中的妊娠率，分別為65%和60%，提示二者都能在很大程度上改善PGS的妊娠結局。但SNP還是表現出了一定的局限性，如高成本的儀器配置，其中包括高分辨率的掃描儀以及繁瑣的操作步驟。

4.二代測序技術（next generation sequencing，NGS）：現有的遺傳學診斷技術僅能為PGS提供有限的分辨率和信息，很大程度上限制了非整倍體篩查與孟德爾遺傳病SNP 分型及新突變位點的綜合分析［35］。二代測序技術的出現為PGS提供了綜合性的單細胞非整倍體篩查。NGS技術具有高通量、低成本和速度快等一系列優勢。Fiorentino等［36］近期將NGS應用于PGS，證明了NGS具有臨床有效性和實用性。但無論是微陣列技術還是NGS，都必須基于PCR 技術，因此單細胞基因組擴增成為NGS技術的關鍵。多重置換擴增技術相對于其他的PCR 技術能夠提供更高的準確性，但依然存在大量的擴增偏倚。哈佛大學的一個研究團隊最近提出了MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）技術，即多次退火環狀循環擴增技術，該技術具有更高的擴增均一性［37］。MALBAC已被用于單個卵母細胞的基因測序［38］。第三代測序技術（de novo sequence），即單分子實時DNA 測序具有更高的檢測速度與較長的讀長，逐漸成為研究的熱點方向。

5.延遲監測（time-lapse monitoring，TLM）技術：延遲監測技術，即利用延時攝像技術對胚胎體外發育過程進行全程監測，根據胚胎發育過程中出現的分裂異常、核重現、多核等現象，初步評價囊胚形成能力和囊胚的染色體組成。常規的胚胎形態學評級方法僅限于在胚胎發育的某一時刻進行觀察評估，并且在操作過程中需要將胚胎暴露在變化的環境中。TLM 在IVF中應用彌補了常規評級方法的不足，通過每5-20分鐘一次的圖像采集來對早期胚胎的發育進行連續評估，因此避免了依靠靜態觀察來 定義一個 動 態 過 程［39］。近 來，TLM 在IVF 中 的應用使得無創性PGS（noninvasive-preimplantation genetic screening，NPGS）成為了可能，所謂無創性PGS，即不進行胚胎活檢的條件下篩選出染色體正常的胚胎進行移植［40］。TML 在PGS 中的應用能夠篩選出具有良好發育潛能的胚胎，并獲得低比率的非整倍體胚胎。Meseguer等［41］在研究中提出，胚胎的形態發育動力學能夠為評估胚胎的發育潛能提供新的形態發育動力學標記（morphokinetic markers），以此來評估胚胎的生長發育潛能并為判斷胚胎的非整倍體提供依據。一項系統性的回顧分析顯示，幾個胚胎發育的動力學參數與后續移植的成功率有顯著的相關性，例如從受精到發育至第五天的時間間隔、兩次卵裂的時間間隔等［39］。Hong等［42］在研究中發現，胚胎出現非整倍體的風險隨著囊胚出現胚泡的時間縮短而降低。而在另一項研究中，Basile等［43］應用胚胎發育早期的幾項形態動力學參數建立模型來提高篩選出正常染色體數目胚胎的可能性。Campbell等［44］應用TLM 建立了胚胎非整倍體風險評估模型，利用該模型選擇低風險的胚胎進行移植，得到了較低的非整倍率。在最近的一項研究中，通過比較TLM 聯合array CGH 的策略與常規的PGS方法，結果顯示兩種方法的聯合應用能夠獲得更高的種植率和妊娠率［45］。

五、PGS的發展前景

PGS發展至今已走過近20 年的歷程，在其發展的前15年中取受精后第3天卵裂期胚胎的1～2個細胞進行FISH 分析成為PGS的常規方法，但隨后幾年的幾項隨機控制實驗卻表明PGS不能在很大程度上改善IVF的妊娠結局，且在這些實驗中多采用種植率作為參考標準。因此，美國生殖醫學學會（ASRM）、歐洲人類生殖與胚胎協會（ESHRE）以及英國生育協會（BFS）等機構認為沒有證據表明PGS在常規IVF 周期中的作用是積極的。盡管前期的臨床實驗并未給PGS帶來可觀的應用前景，但也沒有阻礙PGS技術的發展，新遺傳分析技術的出現為PGS帶來了新的機遇與挑戰。目前，囊胚期活檢聯合aCGH 的全染色體組綜合分析成為PGS的主要發展趨勢，但依然需要考慮其中涉及的效力和成本問題。此外，PGS在IVF中的應用更多的傾向于“以治療為目的”（intended to treat），因此在評估各活檢方法聯合遺傳分析方法的臨床效益時，應賦予繼續妊娠率甚至健康嬰兒出生率更高的權重，并且同時考慮患者所負擔的醫療費用。未來需要進行更多的臨床實驗來確定胚胎植入前各篩查技術的有效性，或探究多方法的聯合應用以改善IVF的妊娠結局。

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