LEA蛋白及其在植物抗逆改良中的應用

王艷蓉張治國吳金霞

（1. 蘭州大學草地農業科技學院，蘭州 730000；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

LEA蛋白及其在植物抗逆改良中的應用

王艷蓉1張治國2吳金霞2

（1. 蘭州大學草地農業科技學院，蘭州 730000；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

干旱、鹽堿、高溫和寒冷等逆境制約著植物的生長發育。植物中含有一組親水性極強的蛋白，稱為胚胎發育晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant，LEA蛋白），在自然條件下這種蛋白質一般在種子發育晚期積累，其對多種非生物脅迫具有很強的抵抗能力，并能響應干旱、寒冷、高鹽和ABA等信號。LEA蛋白通過保持細胞滲透壓、保護細胞膜結構、作為分子伴侶保護其他蛋白等方式維持植物正常的代謝反應。就LEA蛋白的分類、結構、抗逆機制以及在植物抗逆改良中的應用進行了簡要綜述。

LEA蛋白；非生物脅迫；植物抗逆性

植物所在環境常常會對其生存產生各種不利的影響，這些不利的環境因素統稱為逆境。其中非生物脅迫，如干旱、鹽堿、寒冷及澇害制約植物的生長，并造成作物減產。在長期進化過程中，植物形成不同的生理和生化過程以適應或應對非生物脅迫。植物的這種抵抗脅迫的能力被稱為抗逆性［1］。當不利環境來臨時，植物通過代謝反應積累一些保護物質或滲透調節物質（如糖醇、甜菜堿和甘氨酸等）來維持正常的生理生化代謝或調節細胞內滲透壓，以降低環境脅迫帶來的損害。

1 LEA蛋白簡介

1981年，Dure等［2］最早從棉花的子葉中分離得到一類蛋白質，這類蛋白質在棉花胚胎晚期大量積累，并且使胚胎具有干旱耐受性，被命名為胚胎發育晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant，LEA蛋白）。不久，在其他植物的種子和營養器官中相繼發現LEA蛋白，而且大多是在導致植物細胞脫水的情況下得到的。LEA蛋白不僅存在玉米（Zeamays）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）和小麥（Triticum aestivum）等高等植物中，而且在低等植物，如藻類［3］、苔蘚植物［4］和蕨類植物［5］，甚至在細菌、藍細菌［6］及一些無脊椎動物，如蛭形輪蟲（Philodina roseola）［7］等中也存在LEA蛋白，這說明LEA蛋白并不是植物所特有的，而是廣泛分布于生物界中。LEA蛋白的積累往往是和寒冷、高鹽及干旱造成的細胞失水緊密聯系，在外源ABA的誘導下，許多營養器官也可以產生積累LEA蛋白，這說明LEA蛋白既是植物階段發育的產物又是可被誘導的，并且是無組織專一性的。大多數LEA蛋白的分子量較小，富含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等極性氨基酸殘基，缺乏色氨酸、半胱氨酸殘基，這使得LEA蛋白具有極強的親水性和熱穩定性。大多數LEA蛋白具有與親水性蛋白類似的保守氨基酸序列。因此，有些時候LEA蛋白也被分類為親水性蛋白質。親水性蛋白的一個顯著的特點是含有大量的甘氨酸，但并非所有的LEA蛋白都是具有高甘氨酸含量的，所以現在普遍認為LEA蛋白與親水性蛋白在分類上是重疊的。

2 LEA蛋白的分類

最早，Baker等［8］根據在棉花種子中分離到的一些LEA蛋白的cDNA和基因序列曾對LEA蛋白進行過分類闡述。但隨著更多的LEA蛋白在其他物種中被發現，Dure等［9］根據每個組群所含的特定基序將LEA蛋白分為3個組：第1組LEA蛋白包含一個由20個親水性氨基酸所組成的基序；第2組LEA蛋白的特征是具有至少2-3個被Close等［10］命名為K（EKKGIMDKIKEKLPG）、Y（DEYGNP）和S（Sn）的基序；而第3組LEA蛋白具有由11個氨基酸組成的多拷貝基序（TAQAAKEKAXE）。另一種分類方式是由Dure［11］所提出的，分類的依據是棉花種子原型標記，即D-19為第1族，D-11為第2族，D-7為第3族。第2族LEA蛋白也被稱為“脫水蛋白”，因其是一類由脫水誘導的蛋白，但“脫水蛋白”這個命名貌似很牽強，因為其他族的LEA蛋白大多也可以被脫水所誘導。這3族涵蓋了大多數LEA蛋白，但其他LEA蛋白難以分類。對此，Bray［12］豐富了這種分類方式，一些小的LEA蛋白族被提出：D-113為第4族，D-29為第5族，D-34為第6族。此外，還有兩個未編號的特例：LEA5（D-73）和LEA14（D-95）。根據這個分類方式，新發現的LEA蛋白可以根據氨基酸序列或特定的基序編入這幾族中，但還是有極個別的LEA蛋白不能分入其中。

第1族LEA蛋白是由小麥Em基因所表達的，并被分為兩個超家族［13］。通過圓二色譜（circular dichroism，CD）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）結構分析表明，第1族LEA蛋白在溶液中形成高比例的無規則卷曲結構（70%-82.5%），一小部分形成左右螺旋或者多聚脯氨酸結構［14］。雖然其大多包含的是無規則卷曲，但一般具有由20個氨基酸殘基組成的序列GGETRKEQLGEEGYREMGRK，這些氨基酸可以占到全序列的20%-40%，其中甘氨酸殘基的含量約為18%，并且均為極性氨基酸，所以具有極強的親水性，可以作為細胞內保水劑，在植物遭遇干旱、高鹽脅迫時防止細胞失水并降低高鹽離子對細胞的損害。在小麥Em蛋白體外重組試驗中發現，Em蛋白防止檸檬酸合成酶在干燥或寒冷的情況下凝聚或失活［15］。值得一提的是第1族LEA蛋白不僅在植物中被發現，也在枯草芽孢桿菌和鹵蟲中被發現，并且具有保水的功能［16］。第1族LEA蛋白一般在胚胎發育中積累，尤其是在干燥的種子中含量豐富，此外在干旱脅迫的組織器官中也發現它的存在。

第2族LEA蛋白包括3個超家族，常被稱為“脫水蛋白”，其主要存在于包括藻類在內的植物中。其結構特點是具有1-3個特殊的基序：富含賴氨酸的K基序（EKKGIMDKIKEKLPG）、Y基序（DEYGNP）和由多聚絲氨酸組成的S基序（Sn）［9］。其中K基序在一個多肽中可以存在1-11個不等的拷貝，并且常常穿插有保守的F基序；Y基序一般存在于肽鏈的N端，有1-35個拷貝不等；由于富含絲氨酸，S基序往往能被磷酸化。根據所含基序不同，根據基序的排列順序第2族LEA蛋白可分為5個亞族：K亞族、SK亞族、YSK亞族、YK亞族和KS亞族。與第1族LEA蛋白相似，盡管具有一定含量的α螺旋結構，第2族LEA蛋白仍然包含大量無規則卷曲的蛋白質，無論是高溫、金屬離子還是鹽都不能使其形成有序的結構，因此它也是一類親水性蛋白；由于含有豐富的游離羥基，它可以對細胞液與細胞膜具有穩定的作用，從而維持細胞的形態結構；同時第2族LEA蛋白還可以作為分子伴侶對細胞內蛋白進行包裹保護，從而降低干旱對植物的損傷。當外源ABA、干旱、高鹽脅迫信號出現時，第2族LEA蛋白會在植物體內大量合成積累，表現出對脅迫信號的敏感性。據報道，第2族LEA蛋白在所有植物的種子中均有發現，而且在非維管植物（如苔蘚）和蕨類植物（如卷柏［17］）中也有發現。

第3族LEA蛋白最主要的結構特征是具有由11個氨基酸組成的重復基序［10］，但這族LEA蛋白還包含其他的保守基序，如D-7亞族、D-29亞族，它們所含有的保守基序與11個氨基酸組成的保守基序（TAQAAKEKAXE）并不完全相同，這就使得第3族LEA蛋白相對于其他族LEA蛋白具有多樣性。圓二色譜與紅外光譜分析表明第3族LEA蛋白大多缺乏二級結構，在溶液中主要形成無規則卷曲結構，但在緩慢脫水時，第3族LEA蛋白能形成β片層結構；在快速脫水或甘油、甲醇等有機溶劑存在時，則能形成特定的α螺旋結構。此外，SDS也會促進其折疊，說明這些蛋白的結構與脫水速率有關［18］。如果將脫水的蛋白重新溶于水中，有序的α螺旋和β片層結構又會重新形成無規則卷曲，證明這些結構的互變是可逆的［19］。在成熟的種子和花粉細胞中第3族LEA蛋白可以像可溶性糖一樣使細胞質在極度脫水的情況下保持穩定。在豌豆線粒體中發現的第3族LEA蛋白可以與磷脂雙分子層相互作用，并保護其免受干燥的損傷。第3族LEA蛋白廣泛分布于高等植物中，在藻類、苔蘚、蕨類植物中也有發現。有趣的是，在脫水的情況下，一些細菌［20］和線蟲［21］也會積累類似于第3族LEA蛋白的蛋白質。在昆蟲［22］與甲殼類動物［23］中也發現有第3族LEA蛋白的存在。同樣的，第3族LEA蛋白可以響應高鹽、干旱、低溫和ABA信號，并且一些成員還可以響應缺氧［24］和高光強［25］信號。本族LEA蛋白在細胞中呈均勻分布，在成熟的棉花胚胎中濃度可達200 mmol/L［26］，且存在于所有的細胞質溶膠中，這樣的定位可以使LEA蛋白更全面的發揮其功能。在對小麥的研究中發現中，小麥根部缺少第3族LEA蛋白的植株會在干旱環境下死亡。積累在小麥葉綠體中的第3族LEA-L2蛋白可以明顯增加植株的耐寒性，使用組成型表達的小麥LEA-L2蛋白基因轉化擬南芥也獲得了相同的結果，植株的耐寒性明顯增加［25］。還有報道稱，在煙草中過表達玉米的第3族LEA蛋白ZmLEA3可以提高植株對丁香假單胞菌的抗性［27］。這證明LEA蛋白不僅對非生物脅迫具有抗性，而且對生物脅迫也起一定的作用。另外，最近的研究表明，鹵蟲的類第3族LEA蛋白可以在脫水和高鹽環境中提高果蠅細胞的活力［28］。

第4族LEA蛋白最主要的一個結構特點是：在其N端具有一個基序1［AQEKAEKMTA（R/H）DPXKEMAHERK（E/K）（A/E）（K/R）］。根據所含其他特征基序不同，又可以將第4族LEA蛋白分為2個亞族：4A亞族具有一個包含基序2的由80-124個氨基酸殘基組成的肽段；4B亞族包含一個更長的肽段，含有108-180個氨基酸殘基，從棉花中分離的D-113蛋白就屬于4B亞族。結構預測表明本族LEA蛋白的前70-80個氨基酸殘基可以形成α螺旋結構，而其余的部分則形成無規則卷曲。大豆GmPM16蛋白在水溶液中呈無定型狀態，不過在1% SDS或脫水的狀態下，該蛋白90%的部分會形成有序的α螺旋，且這些構象變化是可逆的［29］。最早發現的第4族LEA蛋白是棉花的D-113蛋白，它均勻分布在所有胚胎組織中，濃度可達300 mmol/L［26］。盡管第4族LEA蛋白對ABA有響應［30］，但在逆境中ABA是如何調控LEA蛋白表達的還不得而知。不過在轉錄水平分析中表明，一些第4族LEA蛋白表達的下降與組蛋白的去乙?；嘘P［31］。在擬南芥D-113同源蛋白的體外試驗中發現，其對乳酸脫氫酶具有保護作用，即使是在99%失水的條件下，也能保持乳酸脫氫酶的活性［32］。番茄中瞬時沉默第4族LEA蛋白基因會造成植株對干旱的敏感性提高［33］。這些都表明第4族LEA蛋白在植物應對干旱環境時起到了重要作用。

第5族LEA蛋白相對于其他族LEA蛋白具有更高比例的疏水性氨基酸殘基，凡是疏水氨基酸殘基比例比典型LEA蛋白高的LEA蛋白都包含在本族中，因此本族的LEA蛋白并不都是同源的。根據其序列相似性可以將第5族LEA蛋白分為5A、5B和5C三個亞族。在煮沸的情況下，本族LEA蛋白會形成不可溶的球狀蛋白結構。第5族LEA蛋白同樣在種子發育晚期積累，并可以被干旱、寒冷、高鹽、紫外線和機械損傷等信號所誘導。

最早發現的第6族LEA蛋白是菜豆的PvLEA18蛋白［34］，迄今已在36種維管植物中發現了第6族LEA蛋白，它們的顯著特征是具有較小的分子質量，一般7-14 kD，并且具有高度保守的氨基酸序列。在所包含的4個明顯的基序中，基序1和基序2是高度保守的，基序1保守序列為LEDYK，第6位和第7位分別是脯氨酸和蘇氨酸殘基，基序2則是100%保守的。通常情況下第6族LEA蛋白具有高度的親水性，缺乏半胱氨酸與色氨酸殘基。SDSPAGE電泳顯示第6族LEA蛋白的遷移率比通過氨基酸序列推導預測的遷移率高，其所處的是無定型狀態。第6族LEA蛋白一般也是在干種子和花粉中積累的，同時響應干旱和ABA信號，在生長發育中也會表達。例如，在分生組織中，如頂端分生組織和根原基，維管束中及表皮中都有第6族LEA蛋白的積累，亞細胞定位顯示其在營養器官的細胞質和細胞核中都有表達。與其他族LEA蛋白不同的是，第6族LEA蛋白不能防止酶的脫水失活，其靶蛋白有別于其他族LEA蛋白［32］。

第7族LEA蛋白又叫做ASR蛋白，屬于親水性蛋白質，它們的分子質量較小，具有很高的熱穩定性，且多為無定型蛋白［35］。ASR蛋白在許多雙子葉和單子葉植物中被發現，在裸子植物，如火炬松［36］、銀杏［37］中也有報道，不過在擬南芥中還沒有發現ASR蛋白或同源基因。所有發現的ASR蛋白中都包含3個高度保守的基序，并且都位于肽鏈的C端。其還包含一個核定位信號［38］，番茄的亞細胞組分分離試驗中表明，ASR1蛋白位于細胞核內，不過有的ASR蛋白也位于細胞質內［39］。ASR基因的表達模式在不同植物中是不同的，其會在衰老、果實成熟、種子成熟和花粉成熟過程中積累。ASR蛋白也可以響應干旱、高鹽、寒冷和ABA信號，不過在馬鈴薯中的ASR基因同源物DS2不能響應ABA［40］。番茄的ASR1蛋白在水溶液中呈無定型狀態，不過這種無序的構象在結合鋅離子之后可以轉變為有序的構象，這種構象的改變也可以由脫水引起［35］。

3 LEA蛋白的作用機制

3.1 作為分子伴侶保護其他蛋白

LEA蛋白家族中很多成員可以起到保護細胞內其他蛋白的作用，尤其是第2族LEA蛋白可以保護乳酸脫氫酶免受凍害的損傷。最近的研究顯示，大多數LEA蛋白在干旱的條件下可以保護對脫水敏感的酶，如乳酸脫氫酶、延胡索酸酶、檸檬酸合成酶和蘋果酸脫氫酶等。Goyal等［15］的試驗表明LEA蛋白的保護功能有一部分是通過防止脫水敏感性蛋白的凝聚而發揮作用的，這與分子伴侶在逆境中的作用是相同的。結構分析表明，許多LEA蛋白確實具有與一些分子伴侶相同的多態結構，這也進一步證明了上述觀點。對第1族LEA蛋白EM和第3族LEA蛋白（線蟲的AavLEA1蛋白）研究表明，它們沒有像經典的熱休克蛋白那樣在高溫下防止檸檬酸合成酶的凝聚的能力，但是具有一些抗脫水分子伴侶的功能。通常分子伴侶不僅可以防止蛋白質的凝聚，還可以與靶蛋白短暫地形成復合物，但目前尚不知道LEA蛋白是否也與其靶蛋白形成復合物。LEA蛋白發揮作用的機制并不復雜，它就像一個“分子盾牌”保護著其他蛋白。無定型的、高親水的LEA蛋白在細胞失水、細胞內容物密度增大時可以降低變性多肽間的相互作用，從而降低了其凝聚的可能性［41］。

3.2 去除金屬離子

細胞失水會導致細胞內離子濃度的上升，這可能會破壞細胞內大分子的結構從而影響其功能。由于LEA蛋白富含大量極性氨基酸殘基，可以使其螯合離子。Wise［42］發現鈣離子可以與2b族和3a族LEA蛋白相結合。2b族酸性LEA蛋白ERD10、COR47和ERD14在被磷酸化后可以和鈣離子結合。質譜數據表明這3個蛋白的磷酸化位點位于絲氨酸豐富的基序。本族的Xero2由于不含有這段多聚絲氨酸基序，所以不能被磷酸化，不能結合鈣離子。盡管本族的中性蛋白DHR18也含多聚絲氨酸基序，并可以被磷酸化，但是其不能結合鈣離子。這說明酸性氨基酸殘基在結合鈣離子中也起著重要作用。第2族LEA蛋白可以結合其他金屬離子，但作用機理與結合鈣離子是不同的。通過一系列的試驗表明Fe3+與LEA蛋白具有最高的親和力，其次是Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+。而且許多第2族LEA蛋白可以響應重金屬離子信號，如暴露于汞離子、鎘離子或銅離子的小球藻和菜豆，其中的第2族LEA蛋白基因表達會上調。第2族LEA蛋白與金屬離子的結合也可能與抗氧化功能有關，如柑橘的CuCOR19蛋白可以保護脂質體免受過氧化作用的侵害［43］。體外試驗表明，CuCOR19蛋白可以清除羥自由基和過氧化物自由基［44］，這些活性氧都是由金屬離子催化產生的，并且對機體具有毒害作用。脫水會使這些有催化作用的金屬離子在體內積累。所以LEA蛋白不僅可以直接清除活性氧，而且可以通過螯合催化產生活性氧的金屬離子來保護細胞免受活性氧的傷害［45］。

3.3 穩定膜結構

Steponkus等［46］對Cor15am的研究表明，LEA蛋白可以與膜結合并且穩定膜結構。小麥的第2族酸性LEA蛋白WCOR410在冷脅迫條件下會聚集在質膜上，特別是易受寒冷影響的組織中WCOR410積累量更多。雖然很多第2族LEA蛋白都定位于細胞膜上，但是其他明顯的例子還沒有找到。Koag等［47］在結構上闡述了酸性小單層囊泡上的第2族LEA蛋白的折疊方式，但是并沒有能夠揭示其功能。然而最近的研究表明，豌豆線粒體中的第3族LEA蛋白LEAM可以在干燥環境下抑制小單層囊泡的融合，并且能改變其凝膠晶體的相變溫度［19］。Tolleter等［48］認為LEAM可以在干燥環境下保護線粒體內膜并且占據大部分膜與蛋白結合的區域，這可能對氧化磷酸化過程有所影響，而這種機制還有待進一步的研究。

3.4 作為水和緩沖劑

具有高親水性的LEA蛋白還可以作為水合緩沖劑在干燥的環境下降低細胞水分流失的速率。在干旱、高鹽條件下細胞失水是不可避免的，水合緩沖劑可以保留足夠的水分使蛋白質保持活性。例如，在第2族LEA蛋白的存在下，α淀粉酶在20%聚乙二醇的水溶液中還可以具有活性［49］。Mouillon等［50］闡述了這樣一個模型，在通常情況下LEA蛋白以無規卷曲形態存在，這種形態是高度水合狀態，當細胞失水時，這種無規卷曲會轉變為α螺旋和β折疊結構，從而釋放結合的水分到細胞質中。LEA蛋白就是這樣通過結構轉變在細胞嚴重脫水的情況下增加細胞內的水分。

4 LEA蛋白在植物抗逆改良中的應用

眾所周知，各種非生物脅迫嚴重影響著植物的生長發育。LEA蛋白作為植物在防御非生物脅迫過程中的重要一員，在減少環境脅迫對自身傷害中起到重要的作用?；贚EA蛋白的這種特性，利用基因工程技術使植物過表達內源或外源的LEA蛋白，已經使多種轉基因植物提高了自身的抗逆性，這在植物抗逆改良研究與應用中具有極高的價值和意義。

Xu等［51］運用基因槍轉化方法，將actin1基因啟動子連接大麥HVA1基因構成的表達載體轉化水稻發現，水稻的葉片與根中都有HVA1蛋白積累，植株的耐旱性和抗鹽性都有顯著提高。使用玉米ubi1啟動子在小麥中過表達HVA1基因獲得的轉化株系具有更高的水分利用效率，在干旱環境下，轉基因植株的干重相比野生型有了顯著提高［52］。HVA1基因也被應用于桑樹的改良，運用土壤農桿菌轉化的方法，組成型表達HVA1基因，可以明顯的提高轉基因植株的抗旱、抗鹽性。進而應用脅迫誘導型啟動子rd29A連接HVA1基因轉化桑樹獲得的植株，解除了組成型表達基因在正常條件下的發育遲緩現象，通過對游離脯氨酸、膜穩定系數和PSⅡ活性的測定，轉基因株系提高了對干旱、高鹽和寒冷的耐受性［53］。同樣，在匍匐翦股穎中轉化HVA1基因賦予了轉基因植株在極度缺水的條件下的生存能力［54］。

Cheng等［55］分別用小麥的第1組LEA蛋白PMA1959基因和第2組LEA蛋白PMA80基因轉化水稻，獲得的轉基因株系具有較強的抗旱和抗鹽性，通過分子水平的檢測證明轉基因植株抗逆性的獲得與LEA蛋白的積累是密切相關的。玉米的第5組LEA蛋白Rab28基因是在胚胎發育過程中表達的，并且在組織中可以被干旱和ABA所誘導。使用玉米的組成型啟動子過表達Rab28，后代轉基因植株可以穩定積累Rab28蛋白。相比于野生型，轉基因種子在干旱條件下具有較高的發芽率，轉基因植株可以在15%的PEG溶液中生長，并且植株具有更高的含水量、較少的葉綠素降解和較低的丙二醛含量，這一切可以證明Rab28能顯著提高玉米的抗逆性［56］。OsLEA3-1是可以由干旱、高鹽和ABA誘導的LEA蛋白基因，使用從旱稻分離出的OsLEA3-1的干旱誘導型啟動子、CaMV 35S和水稻actin1啟動子分別在干旱敏感型粳稻中花11中過表達OsLEA3-1，結果發現除轉化actin1啟動子外的轉基因植株在干旱條件下，相比野生型都有產量上的提高。同時發現擁有較少拷貝數的轉基因株系在正常條件下具有較少的產量損失［57］。同樣是在水稻中，Moumita等［58］從耐鹽水稻品種Pokkali中分離得到一種第2組LEA蛋白Rab16A，并用自身誘導型啟動子在鹽敏感秈稻品種Khitish中表達，結果發現使用高鹽處理轉基因植株時Rab16A蛋白會隨著種子的成熟不斷在葉片中積累，并且降低植株葉綠素的破壞，減少鈉離子的積累和鉀離子的流失，這都揭示了Rab16A對植物的保護作用。

Wu等［59］在丹參中分離出一種LEA14組LEA蛋白，命名為SmLEA，將SmLEA基因轉化丹參獲得的轉基因植株在模擬干旱和高鹽條件下具有較快的根伸長率和較低的丙二醛含量，并具有很高的超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽濃度，這對名貴藥材丹參的分子育種具有重要的意義。在甘薯愈傷組織中過表達甘薯的LEA14組LEA蛋白基因IbLEA14，使愈傷組織具有更強的干旱和鹽離子的耐受性，而轉化RNAi載體的愈傷組織表現出對脅迫的敏感性［60］。早在1994年Godoy等［61］就發現了番茄的第2組LEA蛋白TAS14，但直到2012年其抗旱、耐鹽的功能才被驗證。Mu?oz-Mayora等［62］使用CaMV 35S啟動子過表達tas14基因獲得的轉基因株系對干旱和高鹽都具有耐受性，其可以使細胞內積累糖類和鉀離子，并且其作用還與ABA的積累相關。

對于干旱的應答，小立碗蘚往往比被子植物快很多，其抗逆性也常常強于其他被子植物，小立碗蘚的原生質體在失水90%的條件下依舊可以存活。Wang等［63］經過干旱處理小立碗蘚，運用蛋白雙向電泳確定了71個干旱應答蛋白，其中便包括了一些LEA蛋白，這就給植物抗逆改良提供了新的思路。

5 結語

盡管從Dure發現LEA蛋白至今已經過去了30多年，大量LEA蛋白已在不同物種中被發現，其結構也已被較為完整的闡釋，但LEA蛋白作用的分子機理仍然是個未解的難題。缺少與其他已知功能蛋白的相似性，高度無定型的結構都制約著人們對其功能的探索。LEA蛋白在非生物脅迫下的轉錄調控、表達模式都是人們所關注的。雖然大量的實驗結果從不同角度對特定LEA蛋白作用機理進行了闡釋，但由于LEA蛋白家族的特殊性，這些結果并不具有普適性。不過對越來越多表達模型的提出，對模式植物中LEA蛋白突變體的研究，以及轉基因技術的應用都為LEA蛋白功能的研究打開了突破口。LEA蛋白在逆境脅迫中的功能使得其在分子育種上可以發揮極大作用。通過基因工程技術將外源LEA蛋白導入植株表達，可以培育出抗旱、抗寒、耐鹽的作物品種，這對提高糧食產量具有重要意義。

［1］Bartels D， Sunkar R. Drought and salt tolerance［J］. Plant Crit Rev Plant Sci， 2005， 24（1）：23-58.

［2］Dure L， Greenway SC， Galau GA. Developmental biochemistry of cotton seed embryogenesis and germination：changing messenger ribonucleic acid populations as shown by in vitro and in vivo protein synthesis［J］. Biochemistry， 1981， 20（14）：4162-4168.

［3］Honjoh K， Yoshimoto M， Joh T， et al. Isolation and characterization of hardening-induced proteins in Chlorella vulgaris C-27：identification of late embryogenesis abundant proteins［J］. Plant Cell Physiol， 1995， 36（8）：1421-1430.

［4］Saavedra L， Svensson J， Carballo V， et al. A dehydrin gene in Physcomitrella patens is required for salt and osmotic stress tolerance［J］. Plant J， 2006， 45（2）：237-249.

［5］Raghavan V， Kamalay JC. Expression of two cloned Mrna sequences during development and germination of spores of the sensitive fern，Onoclea sensibilis L. ［J］. Planta， 1993， 189（1）：1-9.

［6］Stacy RAP， Aalen RB. Identification of sequence homology between the internal hydrophilic repeated motifs of Group1 lateembryogenesis- abundant proteins in plants and hydrophilic repeats of the general stress protein GsiB of Bacillus subtilis［J］. Planta，1998， 206（3）：476-478.

［7］Thomashow MF. Role of cold responsive genes in plant freezing tolerance［J］. Plant Physiol， 1998， 118（1）：1-8.

［8］Baker J， Van Dennsteele C， Dure L. Sequence and characterization of 6 Lea proteins and their genes from cotton［J］. Plant Mol Biol，1988， 11（3）：277-291.

［9］Dure L III， Crouch M， Harada J， et al. Common amino acid sequence domains among the LEA proteins of higher plants［J］. Plant Mol Biol， 1989， 12（5）：475-486.

［10］Close TJ. Dehydrins：a commonality in the response of plants to dehydration and low temperature［J］. Physiol Plant， 1997， 100（2）：291-296.

［11］Dure LIII. A repeating 11-mer amino acid motif and plant desiccation［J］. Plant J， 1993， 3（3）：363-369.

［12］Bray EA. Molecular responses to water deficit［J］. Plant Physiol，1993， 103（4）：1035-1040.

［13］ Wise MJ. LEAping to conclusions：a computational reanalysis of late embryogenesis abundant proteins and their possible roles［J］. BMC Bioinformatics， 2003， 4：52.

［14］Soulages JL， Kim K， Walters C， et al. Temperature-induced extended helix/random coil transitions in a group 1 late embryogenesis abundant protein from soybean［J］. Plant Physiol，2002， 128（3）：822-832.

［15］Goyal K， Walton LJ， Tunnacliffe A. LEA proteins prevent protein aggregation due to water stress［J］. Biochem J， 2005， 388（Pt-1）：151-157.

［16］Campos F， Cuevas-Velazquez C， Fares MA， et al. Group 1 LEA proteins， an ancestral plant protein group， are also present in other eukaryotes， and in the archeae and bacteria domains［J］. Mol Genet Genomics， 2013， 288（10）：503-517.

［17］Iturriaga G， Cushman MAF， Cushman JC. An EST catalogue from the resurrection plant Selaginella lepidophylla reveals abiotic stress-adaptive genes［J］. Plant Sci， 2006， 170（6）：1173-1184.

［18］Wolkers WF， McCready S， Brandt WF， et al. Isolation and characterization of a D-7 LEA protein from pollen that stabilizes glasses in vitro［J］. Biochim Biophys Acta， 2001， 1544（1-2）：196-206.

［19］Tolleter D， Jaquinod M， Mangavel C， et al. Structure and function of a mitochondrial late embryogenesis abundant protein are revealed by desiccation［J］. Plant Cell， 2007， 19（5）：1580-1589.

［20］ Battista JR， Park MJ， McLemore AE. Inactivation of two homologues of proteins presumed to be involved in the desiccation tolerance of plants sensitizes Deinococcus radiodurans R1 to desiccation［J］. Cryobiology， 2001， 43（2）：133-139.

［21］ Gal TZ， Glazer I， Koltai H. An LEA group 3 family member is involved in survival of C. elegans during exposure to stress［J］. FEBS Lett， 2004， 577（1-2）：21-26.

［22］Kikawada T， Nakahara Y， Kanamori Y， et al. Dehydration-induced expression of LEA proteins in an anhydrobiotic chironomid［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 348（1）：56-61.

［23］Hand SC， Jones D， Menze MA， et al. Life without water：expression of plant LEA genes by an anhydrobiotic arthropod［J］. J Exp Zool Part A Ecol Genet Physiol， 2007， 307（1）：62-66.

［24］Siddiqui NU， Chung HJ， Thomas TL， et al. Abscisic acid-dependent and -independent expression of the carrot late-embryogenesisabundant-class gene Dc3 in transgenic tobacco seedlings［J］. Plant Physiol， 1998， 118（4）：1181-1190.

［25］NDong C， Danyluk J， Wilson KE， et al. Cold-regulated cereal chloroplast late embryogenesis abundant-like proteins：molecular characterization and functional analyses［J］. Plant Physiol， 2002，129（3）：1368-1381.

［26］ Roberts JK， DeSimone NA， Lingle WL， et al. Cellular concentrations and uniformity of cell-type accumulation of two LEA proteins in cotton embryos［J］. Plant Cell， 1993， 5（7）：769-780.

［27］ Liu Y， Wang L， Xing X， et al. ZmLEA3， a multifunctional group 3 LEA protein from maize Zea mays L， is involved in biotic and abiotic stresses［J］. Plant Cell Physiol， 2013， 54（6）：944-959.

［28］ Marunde MR， Samarajeewa DA， Anderson J， et al. Improved tolerance to salt and water stress in Drosophila melanogaster cells conferred by late embryogenesis abundant protein［J］. J. Insect Physiol， 2013， 59（4）：377-386.

［29］ Shih MD， Lin SD， Hsieh JS， et al. Gene cloning and characterization of a soybean（Glycine max L. ）LEA protein， GmPM16［J］. Plant Mol Biol， 2004， 56（5）：689-703.

［30］ Zimmermann P， Hirsch-Hoffmann M， Hennig L， et al. GENEVESTIGATOR：Arabidopsis microarray database and analysis toolbox［J］. Plant Physiol， 2004， 136（1）：2621-2632.

［31］ Tai HH， Tai GC， Beardmore T. Dynamic histone acetylation of late embryonic genes during seed germination［J］. Plant Mol Biol，2005， 59（6）：909-925.

［32］ Reyes JL， Rodrigo MJ， Colmenero-Flores JM， et al. Hydrophilins from distant organisms can protect enzymatic activities from water limitation effects in vitro［J］. Plant Cell Environ， 2005， 28（6）：709-718.

［33］Senthil-Kumar M， Udayakumar M. High-throughput virus-induced gene-silencing approach to assess the functional relevance of a moisture stress-induced cDNA homologous to Lea4［J］. J Exp Bot， 2006， 57（10）：2291-2302.

［34］ Colmenero-Flores JM， Campos F， Garciarrubio A， et al. Characterization of Phaseolus vulgaris cDNA clones responsive to water deficit：identification of a novel late embryogenesis abundant-like protein［J］. Plant Mol Biol， 1997， 35（4）：393-405.

［35］Goldgur Y， Rom S， Ghirlando R， et al. Desiccation and zinc binding induce transition of tomato abscisic acid stress ripening 1， a water stress- and salt stress-regulated plant-specific protein， from unfolded to folded state［J］. Plant Physiol， 2007， 143（2）：617-628.

［36］Padmanabhan V， Dias DM， Newton RJ. Expression analysis of a gene family in loblolly pine（Pinus taeda L. ）induced by water deficit stress［J］. Plant Mol Biol， 1997， 35（6）：801-807.

［37］Shen G， Pang Y， Wu W， et al. Molecular cloning， characterization and expression of a novel Asr gene from Ginkgo biloba［J］. Plant Physiol Biochem， 2005， 43（9）：836-843.

［38］Hara M， Shinoda Y， Tanaka Y， et al. DNA binding of citrus dehydrin promoted by zinc ion［J］. Plant Cell Environ， 2009， 32（2）：532-541.

［39］Kalifa Y， Gilad A， Konrad Z， et al. The water- and salt-stressregulated Asr1（abscisic acid stress ripening）gene encodes a zinc-dependent DNA-binding protein［J］. Biochem J， 2004， 381（Pt2）：373-378.

［40］Dosztányi Z， Csizmók V， Tompa P， et al. The pairwise energy content estimated from amino acid composition discriminates between folded and intrinsically unstructured proteins［J］. J Mol Biol， 2005， 347（4）：827-839.

［41］Olvera-Carrillo Y， Luis Reves J， Covarrubias AA. Late embryogenesis abundant proteins：versatile players in the plant adaptation to water limiting environments［J］. Plant Signal Behav， 2011， 6（4）：586-589.

［42］ Wise MJ， Tunnacliffe A. POPP the question：what do LEA proteins do？［J］. Trends Plant Sci， 2004， 9（1）：13-17.

［43］ Hara M， Terashima S， Fukaya T， et al. Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco［J］. Planta， 2003， 217（2）：290-298.

［44］ Hara M， Fujinaga M， Kuboi T. Radical scavenging activity and oxidative modification of citrus dehydrin［J］. Plant Physiol Biochem， 2004， 42（7-8）：657-662.

［45］Hanin M， Brini F， Ebel CH， et al. Plant dehydrins and stress tolerance：versatile proteins for complex mechanisms［J］. Plant Signal Behav， 2011， 6（10）：1503-1509.

［46］ Steponkus PL， Uemura M， Joseph RA， et al. Mode of action of the COR15a gene on the freezing tolerance of Arabidopsis thaliana［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95（24）：14570-14575.

［47］Koag MC， Fenton RD， Wilkens S， et al. The binding of maize DHN1 to lipid vesicles. Gain of structure and lipid specificity［J］. Plant Physiol， 2003， 131（1）：309-316.

［48］Tolleter D， Jaquinod M， Mangavel C， et al. Structure and function of a mitochondrial late embryogenesis abundant protein are revealed by desiccation［J］. The Plant Cell， 2007， 19（5）：1580-1589.

［49］Rinne PL， Kaikuranta PL， van der Plas LHW， et al. Dehydrins in cold-acclimated apices of birch（Betula pubescens Ehrh. ）：production， localization and potential role in rescuing enzyme function during dehydration［J］. Planta， 1999， 209（4）：377-388.

［50］Mouillon JM， Gustafsson P， Harryson P. Structural investigation of disordered stress proteins. Comparison of full-length dehydrins with isolated peptides of their conserved segments［J］. Plant Physiol，2006， 141（2）：638-650.

［51］Xu DP， Duan XL， Wang BY. Expression of a late embryogenesis abundant protein gene， HVA7， from barley confers tolerance to water eeficit and salt stress in transgenic rice［J］. Plant Physiol，1996， 110（1）：249-257.

［52］Sivamani E， Bahieldin A， Wraith JM， et al. Improved biomass productivity and water use efficiency under water deficit conditions in transgenic wheat constitutively expressing the barley HVA1 gene［J］. Plant Science， 2000， 155（1）：1-9.

［53］Checker VG， Chhibbar AK， Khurana P. Stress-inducible expression of barley HVA1 gene in transgenic mulberry displays enhanced tolerance against drought， salinity and cold stress［J］. TransgenicRes， 2012， 21（5）：939-957.

［54］Fu DL， Huang BR， Xiao YM， et al. Overexpression of barley HVA1 gene in creeping bentgrass for improving drought tolerance［J］. Plant Cell Rep， 2007， 26（4）：467-477.

［55］Cheng ZQ， Targolli J， Huang XQ， et al. Wheat LEA genes， PMA80 and PMA1959， enhance dehydration tolerance of transgenic rice（Oryza sativa L. ）［J］. Molecular Breeding， 2002， 10（1-2）：71-82.

［56］Amara I， Capellades M， Ludevid MD， et al. Enhanced water stress tolerance of transgenic maize plants over-expressing LEA Rab28 gene［J］. Journal of Plant Physiology， 2013， 170（9）：864-873.

［57］Xiao BZ， Huang YM， Tang N， et al. Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions［J］. Theor Appl Gene， 2007， 115（1）：35-46.

［58］Ganguly M， Datta K， Roychoudhury A， et al. Overexpression of Rab16A gene in indica rice variety for generating enhanced salt tolerance［J］. Plant Signaling & Behavior， 2012， 7（4）：502-509.

［59］Wu YC， Liu CL， Kuang J， et al. Overexpression of SmLEA enhances salt and drought tolerance in Escherichia coli and Salvia miltiorrhiza［J］. Protoplasma， 2014， 215（5）：1191-1199.

［60］Park SC， Kim YH， Jeong JC， et al. Sweetpotato late embryogenesis abundant 14（IbLEA14）gene influences lignification and increases osmotic- and salt stress-tolerance of transgenic calli［J］. Planta， 2011， 233（3）：621-634.

［61］ Godoy JA， Lunar R， Torres-Schumann S， et al. Expression， tissue distribution and subcellular localization of dehydrin TAS14 in saltstressed tomato plants［J］. Plant Mol Biol， 1994， 26（6）：1921-1934.

［62］Munoz-Mayora A， Pineda B， Garcia-Abellan JO， et al. Overexpression of dehydrin tas14 gene improves the osmotic stress imposed by drought and salinity in tomato［J］. Journal of Plant Physiology，2012， 169（5）：459-468.

［63］Wang XQ， Yang PF， Liu Z， et al. Exploring the mechanism of Physcomitrella patens desiccation tolerance through a proteomic strategy［J］. Plant Physiology， 2009， 149（4）：1739-1750.

（責任編輯 狄艷紅）

LEA Protein and Its Application in Improvement of Stress Tolerance in Plants

Wang Yanrong1Zhang Zhiguo2Wu Jinxia2
（1. College of Pastoral Agriculture Science and Technology， Lanzhou University，Lanzhou 730000；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Adverse conditions， including drought， salinity and extreme temperatures， often restrict the growth and development of plants. In plants， there exist a group of highly hydrophilic proteins， known as LEA（late embryogenesis abundant）proteins， which generally accumulate at the last stage of embryogenesis under natural conditions. It has a strong resistance to various abiotic stresses， and can respond to drought， cold，high salt and ABA signals. LEA proteins can maintain normal metabolic reactions of plants by maintaining cellular osmotic pressure， protecting the cell membrane structure and functioning as a molecular chaperone to protect other proteins. In this paper， the classification， structure， stress tolerance mechanisms of LEA protein and its application in improvement of stress tolerance in plant were reviewed.

LEA protein；abiotic stresses；stress tolerance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.001

2014-11-12

國家“973”計劃項目（2014CB138700）

王艷蓉，女，碩士研究生，研究方向：草業生物技術；E-mail：wangyanrong915@163.com

吳金霞，女，副研究員，研究方向：植物基因功能組學；E-mail：wujinxia@caas.cn