SSR分子標記在煙草研究中的應用進展

陳杰楊靜龍勝賢肖慈平楊昌義黃清忠王維

（1.貴州省黔東南州煙草公司，凱里 556000；2. 華南農業大學農學院 華南農業大學煙草研究室，廣州 510642）

SSR分子標記在煙草研究中的應用進展

陳杰1楊靜1龍勝賢1肖慈平1楊昌義1黃清忠1王維2

（1.貴州省黔東南州煙草公司，凱里 556000；2. 華南農業大學農學院 華南農業大學煙草研究室，廣州 510642）

SSR分子標記技術作為最常用的分子標記技術之一，該標記技術重復性好，結果可靠，近年來在煙草遺傳育種中展示了廣闊的應用前景，是應用潛力較大的分子標記技術。介紹了SSR分子標記的原理及其分布特征，對其在煙草基因定位及分子標記輔助選擇、種質資源研究、遺傳圖譜構建及種子純度及真偽鑒定研究中的應用等方面進行了綜述，并探討了SSR分子標記技術在煙草遺傳育種中的應用前景，以期為煙草SSR分子標記技術的研究提供參考。

煙草；分子標記；SSR；遺傳育種

在生物個體間，最本質的差異是DNA分子水平間的差異，DNA分子標記技術是對遺傳物質本身差異的直接檢測，能準確地反映動植物遺傳組成全貌，因此DNA是最為可靠的遺傳標記。DNA分子標記能對不同發育時期的個體、任何組織甚至器官作檢測，其具有數量豐富、涉及全基因組、遺傳穩定、多態性高、不受外界環境影響、無上位性作用等一系列顯著優點［1］，DNA分子標記技術自誕生之日起，就引起了生物科學家們極大的興趣。自1974年，Grozdicker等［2］利用限制性內切酶酶解后得到的DNA片段的差異鑒定溫度敏感表型的腺病毒DNA突變體，首創了DNA分子標記技術以來，DNA分子標記技術日趨成熟、完善［3］。目前最常用的分子標記有RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR 等。與其他幾種常用的分子標記技術相比，SSR標記具有信息量更高、多等位點、共顯性、穩定可靠及操作簡便等顯著優點，在基礎理論研究和實際應用等方面取得了巨大的成績，廣泛地應用于遺傳育種、物種親緣關系鑒別、基因組作圖、基因定位、基因庫構建和基因克隆等方面。

1 SSR分子標記技術的原理和特點

簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR），又稱微衛星DNA（micro-satellite DNA），是指以少數幾個核苷酸（1-6個）為單位多次串聯重復的DNA序列，重復次數一般為10-50，亦稱簡單序列長度多態性（simple sequence length polymorphism，SSLP）。同一類微衛星DNA可分布在基因組的不同位置上，由于基本單元重復次數的不同，而形成SSR座位的多態性。每個SSR座位兩側一般是相對保守的單拷貝序列，因此可根據兩側序列設計一對特異引物來擴增SSR序列，經聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴增帶的遷移距離，從而獲知不同個體在某個SSR座位上的多態性。

這種重復序列存在于幾乎所有真核生物的基因組中，含量豐富，且呈隨機均勻分布。微衛星由核心序列和兩側的保守側翼序列構成，保守的側翼序列使微衛星特異地定位于染色體某一區域，核心序列重復數的差異則形成微衛星的高度多態性。近年來，SSR分子標記技術成為種群研究和進化生物學最常用的分子標記之一，廣泛地應用于種群遺傳多樣性分析、基因定位及分子標記輔助選擇、遺傳連鎖圖譜的構建［4］。與其他作物相比，煙草SSR標記開發研究起步較晚。近年來，隨著煙草基因組計劃取得的巨大成就，SSR分子標記技術在煙草遺傳育種中運用越來越廣泛及深入。

2 煙草EST-SSR分布特征

隨著分子生物學技術的高速發展，植物表達序列標簽（expressed sequence tags，ESTs）得到大量測定，EST數據的快速增長為SSR標記的開發提供了豐富的序列資源，使得基于EST序列進行SSR標記開發的能力大大增強。

王衛鋒等［5］通過對絨毛狀煙草基因組中SSR位點的信息分析發現，A/T堿基出現的頻率顯著高于G/C，二、三堿基重復基元的SSR占SSR總體的94.8%，出現頻率最高。而（CG）n、（GTG）n、（GTC）n、（GCA）n、（CGC）n這些重復單元的SSR在絨毛狀煙草基因組中非常少見，分別只出現了1次，得出煙草SSR序列顯示出顯著的堿基偏好性的結論。薛金愛等［6］對GenBank上公布的158 098條EST序列及10 647條GSS序列進行大規模微衛星位點搜索，在EST和GSS中搜索到的重復單元中二核苷酸發生的次數最多，在EST中TC發生的頻率最高，在GSS中出現最多的是TA；其次是三核苷酸，其中發生次數最多的分別是TGA和CAA。李緒英等［7］對煙草葉綠體和線粒體基因組數據中的SSR信息進行了分析，分別獲得186和578個SSR位點，且這些SSR重復堿基類型絕大部分為二、三堿基重復。

在大多數植物中，EST-SSR分布以二、三核苷酸重復類型為主，而且在二核苷酸重復的EST-SSRs中，含AG/TC的重復單元最多，煙草EST-SSR的分布特征與其他大多數植物基本一致［8-15］。

3 SSR標記在煙草遺傳育種中的應用

3.1 基因定位及分子標記輔助選擇

傳統的煙草育種主要依賴于植株表型選擇和抗性鑒定，要求育種者須有豐富的經驗，育種周期也較長，且極易受到病蟲害發生狀況及氣候條件的限制，導致鑒定結果出現偏差，甚至造成優良抗性基因的丟失，選擇效率較低［16，17］。因此，如何快速選育抗病優質煙草新品種是廣大煙草育種工作者面臨的主要問題之一。分子標記輔助選擇（molecular marker-assisted selection，MAS）利用與目標性狀相連鎖的分子標記可以對育種材料從DNA水平上進行高效選擇，從而對作物產量、品質和抗性等性狀進行改良，同時因其不受基因效應和環境因素的影響，選擇結果可靠性比較高，從而解決了育種年限長的問題，大大提高育種進程［17］。SSR分子標記輔助選擇近年來在煙草上得到了越來越多的應用。

范靜苑、文軻等［18，19］利用抗CMV的烤煙品種臺煙8號構建分離群體進行遺傳分析，分別篩選到一個與抗性基因相關的SSR標記，并探討了煙草CMV的抗性遺傳規律，認為臺煙8號對CMV的抗性由多基因控制。同時范靜苑等還篩選到一個與來源于鐵把子的與CMV抗性基因相關的SSR標記。吳海喬［20］利用1 152對SSR標記對煙草青枯病抗病品種巖煙97與感病品種紅花大金元構建的F2群體進行分析，篩選出4個在抗、感池間表現差異的標記。范江等［21］以抗青枯病的煙草品種‘Oxford207'與感病品種紅花大金元為親本構建群體，從800多條SSR引物中篩選出3個在抗感池之間有多態性的引物，并得出來自‘Oxford207'的青枯病抗性基因屬于加性基因控制的結論。蔣彩虹等［22］在篩選到的一個與凈葉黃抗赤星病基因的遺傳距離為9.37 cM標記的基礎上，在該標記的兩側10 cM范圍內分別選擇15對SSR引物對抗病親本凈葉黃與感病親本NC82的雜交F2進行SSR標記分析，篩選到一個與來源于凈葉黃的赤星病抗性基因間的遺傳距離為4 cM的標記。牟建英等［23］從2 317對SSR引物中篩選得到61對多態穩定的引物，用其對臺煙7號（♀）×NC89（♂）構建的285株F2群體進行分析，檢測到1個與煙草白粉病抗性基因緊密連鎖的SSR標記。

分子標記輔助選擇育種的關鍵是尋找與目的基因緊密連鎖的分子標記，兩者連鎖越緊密，則標記與目的基因的重組率越低，選擇效率也就越高。分子標記輔助選擇將現代分子生物學與傳統育種學結合，為植物育種工作提供不受環境影響、可量化的標準方法，使作物遺傳育種進入了一個嶄新的階段。近年來，利用SSR分子標記輔助選擇技術已在水稻、小麥、玉米、棉花和番茄等作物的抗病性育種中取得了巨大的成就，并且通過分子標記輔助選擇技術將多個抗病基因進行有效聚合，培育出廣譜抗性持久、穩定的品種，解決了利用轉基因技術進行抗性育種耗時、成本昂貴，基因沉默、遺傳不夠穩定及安全性等問題［24-29］。然而，分子標記輔助選擇聚合育種在煙草育種中還未見相關報道，這主要可能是由于目前在煙草的抗性基因定位中還沒有找到一個與目的基因緊密連鎖的標記造成的。

3.2 煙草分類及遺傳多樣性研究

DNA多樣性是遺傳多樣性的本質，種質資源遺傳多樣性的發展經歷了形態學標記（morphological markers）、細胞學標記（cytological markers）、生物化學標記（biochemical markers）和分子標記（molecular markers）4個主要階段。由于分子標記技術不受環境、季節的影響，與其他遺傳標記相比，更適合用于動、植物分類和遺傳多樣性研究。劉勝傳、葉蘭欽和李文平等［30-32］分別應用SSR分子標記技術分析了部分煙草種質的遺傳多樣性，都得出了煙草品種間遺傳差異較小的結論。聶瓊等［33］利用從番茄、辣椒的SSR引物中篩選出8對重復性好、多態性高的同源性SSR引物對24份烤煙材料進行遺傳差異性分析得出，同科植物的SSR引物也能夠較好地揭示煙草種質資源遺傳背景和親緣關系，可應用于煙草品種資源的遺傳差異分析的結論。徐軍等［34］利用SSR標記構建了80份普通煙草種質的指紋圖譜。王曼等［35］利用10對SSR引物對吉林省11份曬煙種質和2份烤煙種質進行遺傳多樣性與親緣關系進行分析，得出不同煙草類型種間遺傳差異明顯，而種內遺傳基礎相對狹窄的結論。黃莉莎等［36］從62對SSR引物中篩選出21對多態性高、穩定性好的核心引物對9份煙草主栽品種進行DNA指紋圖譜構建，發現9個品種間遺傳關系較近。楊柳等［37］利用14對多態性好、條帶清晰的煙草SSR引物，對25份煙草種質資源親緣關系進行分析，其研究認為25份普通煙草種質間的遺傳差異與其品種特性、調制類型、地理來源的差異沒有必然聯系，但較好地反映了煙草種質間親緣關系。

遺傳多樣性不僅反映出物種變異水平的高低，而且能體現變異的分布格局，準確反映物種的血緣關系、育種背景和利用價值，對優質種質資源的保護、育種潛力的發掘利用、雜交種的選配、育種效率的提高具有重要意義［38，39］。對煙草種質資源親緣關系的研究表明，我國煙草品種間遺傳距離較窄，煙草育種工作面臨親本匱乏，主體親本使用過度、重復性大等問題，因此在今后的育種工作中要積極引入外源基因，加大優質野生種質資源的利用，拓寬種質的遺傳基礎［40，41］。

3.3 遺傳圖譜的構建及種子純度和真偽鑒定

擁有一張高密度分子標記遺傳圖譜是開展分子標記輔助選擇以及基因定位工作的基礎，1978年Donis-Keller等［42］首次利用RFLP標記構建了人類的第一張基因連鎖圖譜，從此DNA分子標記技術就開始廣泛地應用于各種動、植物遺傳圖譜的構建中。目前，在水稻、小麥、玉米和番茄等作物中已經擁有了高密度甚至飽和的遺傳連鎖圖譜［43-46］。近年來，隨著SSR分子標記的大量開發，SSR分子標記技術越來越多地應用到煙草遺傳連鎖圖譜的繪制。

2001年，Lin等［47］利用RFLP標記技術構建了第一張煙草分子標記遺傳連鎖圖譜。肖柄光等［48］以烤煙品種雜交得到的137個DH系為作圖群體，利用ISSR和RAPD標記的遺傳連鎖分析構建了包括27個連鎖群在內的國內外第一張烤煙分子標記遺傳連鎖圖譜。Bindler等［49］利用Hicks Broad Leaf和Red Russian雜交產生的186個F2單株作為作圖群體，構建了第一張煙草SSR標記遺傳連鎖圖，之后Bindler等［50］在2007年工作的基礎上，利用已經公開發表的1379 067個煙草原始基因序列（GSS）和55 411個表達序列（ESTs）設計出5 500個SSR引物，從這5 500個引物中篩選出2 317個多態性、重復性好，條帶清晰的SSR標記，利用Hicks Broad Leaf和Red Russian雜交產生的186個F2單株作為作圖群體，構建了包括2317個SSR標記，2 363個位點在內的24個連鎖群，總遺傳長度為3 267 cM，標記間的平均距離小于1.5 cM。這是目前包含標記位點最廣、標記密度最大、平均圖距最小的煙草分子連鎖圖譜。

隨著我國煙草育種研究的不斷深入，越來越多的優良、抗逆性強的品種被選育和引進，為解決我國煙草品種單一問題提供了有力的支撐，然而同時也增大了品種混雜的可能性。煙草種子純度和真實性是優良品種生產的保證。建立快速、準確的煙草種子純度鑒定技術是對規范我國煙草種子市場和促進我國煙草產業發展的迫切需要。隨著科技進步，分子標記技術已經開始用于作物種子純度的鑒定。利用SSR標記技術構建指紋圖譜鑒定種子純度和真偽在水稻、玉米、棉花和油菜［51-54］等作物中具有較多的研究，但在煙草種子方面的應用很少有文獻報道。

總體上，煙草分子標記遺傳圖譜構建及在種子純度和真偽鑒定等研究中的應用程度遠遠落后于其他作物，這可能是由于栽培種煙草屬于異源四倍體，有48條染色體，全長約4 600 Mb，約為人類基因組全長的1.5倍，基因組巨大和分子標記在煙草中開發利用較少造成的［55］。

4 前景

加強作物育種，必須加大對分子育種技術的應用。近年來，育種學家對利用分子生物學手段進行作物育種表現出濃厚的熱情，但目前煙草SSR標記的開發遠遠落后于其他作物。煙草染色體數目較多，基因組龐大，包含大量的重復序列，這給煙草基因組物理圖譜的構建和測序造成了極大的困難。因此到目前為止可利用的分子標記數量也十分有限，難以構建高密度的煙草遺傳連鎖圖譜，無法篩選到與目標基因緊密連鎖的分子標記。將與目標基因連鎖的分子標記運用于遺傳育種的早期輔助選擇，仍停留在基礎理論研究階段，目前還沒有通過有利基因聚合的分子育種煙草產品的報道［56］，尤其是在煙草抗旱、耐寒、抗早花基因篩選方面缺乏相關研究。近年來，煙草單染色體分離擴增技術在煙草中開始有研究，對于煙草這類大基因組的物種而言，構建高覆蓋率的單染色體文庫能夠解決高密度煙草遺傳圖譜的繪制和煙草基因組測序的難題［57］。

目前煙草基因組計劃（TGI）已取得巨大進展，近幾年各國啟動的煙草基因組計劃將煙草基礎研究推向了高潮。據報道，我國現已成功完成絨毛狀煙草與林煙草全基因組序列圖譜，這是全球第一套煙草全基因組序列（http：//scitech.people.com. cn/GB/16572602.html）。同時基因比較作圖研究也成為國際研究熱點，SSR標記同源性、通用性的研究也在煙草中展開［58，59］。這些技術的發展及取得的成果為煙草ESTs數量迅速增加、SSR標記的開發和高密度的分子連鎖圖譜的構建提供重要的依據，為獲得與目標基因緊密連鎖的分子標記、基因的精確定位、分子標記輔助選擇提供重要前提，從而達到簡化傳統育種方法的目的。在未來，利用SSR分子標記技術開展煙草分子設計育種一定會成為煙草育種的熱點。

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（責任編輯 狄艷紅）

Advance of the Application of SSR Molecular Markers in Tobacco Research

Chen Jie1Yang Jing2Long Shengxian1Xiao Ciping1Yang Changyi1Huang Qingzhong1Wang Wei2
（1. Qiandong-nan Tobacco Company in Guizhou Province，Kaili 556000；2. Tobacco Laboratory，College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

SSR molecular marker technology as one of the most commonly used molecular markers， the marker technique result is reliable and good repeatability. In recent years， SSR marker shows a broad application prospect in tobacco genetic breeding， is a large potential for application of molecular markers. This paper introduced the principle and distribution characteristics of SSR molecular marker， and summarized the study of gene location and molecular marker-assisted selection， germplasm research， the construction of molecular genetic maps and the seed purity identification and authenticity of tobacco， and analysed the application prospect of molecular markers in tobacco genetic breeding. The main aim is to supply useful information so as to promote the development of SSR molecular marker technology research in tobacco.

tobacco；molecular marker；SSR；genetic breeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.006

2014-7-30

國家煙草專賣局重點項目（110200902043）

陳杰，男，碩士研究生，研究方向：煙葉生產及科技推廣應用；E-mail：hnchenjie002@126.com

王維，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：煙草栽培與生理；E-mail：wangwei@scau.edu.cn