基于高通量測序技術的細菌非編碼RNA研究方法進展

郭明璋 許文濤

（中國農業大學食品科學與營養工程學院 食品安全與分子生物學實驗室，北京 100083）

基于高通量測序技術的細菌非編碼RNA研究方法進展

郭明璋 許文濤

（中國農業大學食品科學與營養工程學院 食品安全與分子生物學實驗室，北京 100083）

細菌非編碼RNA指細菌中不編碼蛋白質，而以RNA的分子形式起調控作用的一類核酸分子。高通量測序技術的應用極大地推進了多種細菌中非編碼RNA的發現工作，但由于現階段對細菌非編碼RNA特征的認識尚不夠深入，該領域測序數據的生物信息學分析還存在許多不足。介紹了應用高通量測序技術研究細菌非編碼RNA的兩種主要技術——RNA-seq技術和dRNA-seq技術，對現行的篩選非編碼RNA的生物信息學分析方法進行綜述，并對該領域生物信息學分析策略的改進提出設想。

細菌；非編碼RNA；高通量測序；生物信息學

非編碼RNA指不編碼蛋白質，對基因表達等生理過程或核酸、蛋白質等物質活性起調控作用的RNA。真核生物中的非編碼RNA，如miRNA、piRNA、lncRNA等已經得到了深入的研究。相比而言，原核生物非編碼RNA的研究還處于初級階段。細菌中的非編碼RNA通常統稱為non-coding RNA（ncRNA）或small RNA（sRNA），但也有些研究者以sRNA表示反式調控作用的非編碼RNA，以區分反義RNA（antisense RNA，asRNA）、核糖開關（Riboswitch）、長重疊非編碼區（long overlapping UTR）等順式調控元件，本文傾向于使用后一種表述方式。

雖然細菌在進化中比較低等，但其所處環境復雜多變，決定了它們必須具有一套反應迅速的調控系統［1］，因此非編碼RNA的調控作用對細菌來說至關重要。已知的細菌非編碼RNA調控機制包括順式互補配對調控基因表達、反式互補配對調控基因表達、調控蛋白質活性、聚簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）等類型［2］。非編碼RNA調控涉及細菌碳代謝、氨基酸代謝、鐵元素調控、群體效應和生物膜形成、對各種不良環境的耐受性以及病原微生物的致病性等各個方面［3］。非編碼RNA與轉錄因子等傳統的調控元件構成了復雜的調控網絡，成為介導環境和細菌生理狀態的重要橋梁。

近10年來，研究者對細菌非編碼RNA認識的逐步深入有賴于研究技術的快速發展，其中細菌非編碼RNA大規模發現技術經歷了Hfq蛋白免疫共沉淀技術、基于基因組數據進行計算機預測技術、Tiling芯片技術和高通量測序技術。高通量測序技術因其高通量性、無偏性和廣泛適用性，現在已成為發現新非編碼RNA的主流方法。在某些菌種中，利用高通量測序技術發現的非編碼RNA已經超過以往所有方法發現的非編碼RNA的總和［4］。

測序可以產生大量RNA序列數據，如何從這些海量數據中高效準確地篩選出非編碼RNA，是基于高通量測序細菌研究非編碼RNA的關鍵。與真核生物相比，細菌非編碼RNA具有長度不一致、二級結構不一致、在基因組中的位置不一致等特點［5］，導致進行生物信息學分析難度較高。目前利用高通量測序技術發現非編碼RNA已在多種細菌中有所應用，但是不同的研究者往往采用不同的測序和生物信息學分析策略，尚未形成統一的標準方案和流程。本文將對基于高通量測序技術的細菌非編碼RNA研究進行綜述，旨在能為相關研究者提供參考。

1 測序策略：RNA-seq和dRNA-seq

2008年德國馬克斯普朗克傳染病生物學研究所的J?rg Vogel研究團隊最早發表論文報道了應用高通量測序技術對細菌非編碼RNA進行的研究［6］。該研究首先通過免疫共沉淀技術分離出了鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella entericaserovar Typhimurium）中與Hfq蛋白相結合的非編碼RNA，再對RNA進行RNA-seq測序。雖然Hfq蛋白是重要的非編碼RNA結合蛋白，但并非所有的非編碼RNA都通過與Hfq蛋白結合發揮作用，并且在一些細菌中并不存在Hfq蛋白［7］，因此這種Hfq蛋白免疫共沉淀依賴的RNA-seq技術存在一定的局限性。直接對細菌總RNA進行克隆測序的方法可以更廣譜地發現新的非編碼RNA，然而由于細菌總RNA中95%以上的都是tRNA和rRNA［8］，因此直接對總RNA進行克隆測序難以高效地得到非編碼RNA的信息。2009年Liu等［9］首次報道了原核生物中穩定的rRNA和tRNA去除方法，從而實現了直接克隆（direct cloning）的非編碼RNA-seq研究。該研究提取霍亂弧菌（Vibrio cholerae）總RNA并分離出14-200 nt長度范圍的轉錄本，去除rRNA和tRNA后直接進行高通量測序的研究，發現了大量的非編碼RNA。隨后類似的直接克隆RNA-seq技術被應用到大腸桿菌（Escherichia coli）［10，11］、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）［4，12］、結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）［13］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［14，15］、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）［16］、鼠疫耶爾森菌［17］等菌種的非編碼RNA研究中。

2009年J?rg Vogel團隊又開發了一種新的細菌非編碼RNA測序策略，即dRNA-seq（differential RNA-seq）技術，用以研究幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）的初級轉錄本和非編碼RNA［18］。該技術將總RNA分成兩份，其中一份直接進行測序，另一份中加入5'單磷酸依賴的外切酶（Terminator 5'-phosphate-dependent exonuclease，TEX）處理，選擇性地降解5'端具有單磷酸的加工過的轉錄本，包括rRNA、tRNA以及部分降解的RNA片段，只保留5'端具有三磷酸的初級轉錄本，即未經加工的mRNA及非編碼RNA，再進行建庫測序。通過比較兩份樣品的測序結果，dRNA-seq技術可以有效地確定非編碼RNA的轉錄起始位點（Transcriptional start sites，TSS）以及mRNA的非編碼區（UTR），對于研究順式調控的核糖開關和長非編碼區是非常有利的。通過dRNA-seq技術，研究者已在根癌 農 桿 菌（Agrobacterium tumefaciens）［19］、 枯 草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［20］、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacteriumg lutamicum）［21］、單增李斯特菌［22］、結核分枝桿菌［23］、鼠傷寒沙門氏菌［24］、天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）［25］等菌株中發現了大量的非編碼RNA。dRNA-seq技術比傳統的RNA-seq技術得到的信息更加豐富和準確，今后很有可能成為高通量測序依賴的非編碼RNA研究技術的主流。

2 非編碼RNA的篩選與分析策略

細菌非編碼RNA的篩選指標很多，但適用于所有非編碼RNA的共有特征卻較少。表達豐度是細菌非編碼RNA篩選的先決指標，但由于不同研究中測序數據量的不同，表達豐度閾值只能依據研究對象具體情況而設定。序列對應在基因組中的位置是比較通用的細菌非編碼RNA篩選指標。當此指標篩選出來的潛在非編碼RNA過多時，研究者會利用轉錄信號、序列保守性等特征進一步篩選，以縮小非編碼RNA的范圍。由于研究者對于非編碼RNA的二級結構、Hfq結合性等特征的認識還不夠深入，因此目前還難以通過這些特征對非編碼RNA進行篩選，只能對篩選出來的這些非編碼RNA特征進行分析。

2.1 序列對應在基因組上位置的篩選

無論是RNA-seq還是dRNA-seq研究，序列對應在基因組上的位置都是首要的非編碼RNA篩選的指標：sRNA來源于基因間區，asRNA來源于基因的互補鏈對應序列。Integrated Genome Browser［26］，Integrative Genomics Viewer［27］等軟件可以形象化地展示測序數據在基因組上的位置，供研究者人工篩選非編碼RNA。

關于基因間區的定義在不同研究中有所差異。Irnov等［20］將基因組上距離上下游注釋基因編碼區距離大于25 nt的區域定義為基因間區，在其他的研究中也有將此最小距離設置為30 nt［28］、60 nt［25］、80 nt［13］和100 nt［22］。基因區間定義的不同主要是由于研究者對細菌基因UTR區長度的認識不同。dRNA-seq技術研究表明細菌的5' UTR區通常較短，大部分mRNA的5' UTR為20-40 nt，但也有某些mRNA的5' UTR可以長達幾百個堿基［18，20，22，24］，因此不同基因間區的定義體現了對非編碼RNA篩選的準確度和靈敏度的不同要求，難以形成統一的標準。另外，不同研究者對asRNA在基因組中位置的篩選條件也不同。有的研究要求asRNA必須與基因的編碼區有重疊區域［22］，也有的研究中考慮到asRNA可能作用于mRNA的非編碼區，因此將與基因編碼區上下游一定長度范圍有重疊的非編碼RNA也定義為asRNA［21］。

2.2 轉錄信號分析

在原核生物非編碼RNA的生物信息學分析中，轉錄起始位點、啟動子和終止子是主要的轉錄信號。應用dRNA-seq技術可以有效地確定轉錄起始位點，而應用RNA-seq技術得到的非編碼RNA的轉錄起始位點可能不準確。Shinhara等［10］應用RNA-seq技術研究大腸桿菌中的非編碼RNA時，在篩選條件中加入了轉錄起始的預測證據和實驗證據，即以預測的sigma70結合位點為預測證據，以文獻中報道的大腸桿菌轉錄起始位點為實驗證據，對測序獲得的非編碼RNA進行篩選和起始位點的校正。

啟動子和終止子分析在RNA-seq測序和dRNA-seq測序的生物信息學分析中都很常見。啟動子的預測通常需先將非編碼RNA轉錄起始位點前一定長度的序列提取出來，在應用dRNA-seq測序的研究中通常取轉錄起始位點前的40-50 nt的序列進行啟動子分析，而在應用RNA-seq測序的研究中，由于轉錄起始位點的相對不準確性，通常取更長的50-100 nt長度的序列進行分析。BPROM［29］、HMMER［30］等軟件可以進行啟動子的預測。非Rho因子依賴的終止子預測通常在非編碼RNA的3'端進行，TransTermHP［31］是最為常用的非Rho因子依賴的終止子預測軟件。

雖然啟動子和終止子分析在非編碼RNA的研究中很常見，但是只有少數研究以啟動子和終止子的存在與否作為篩選非編碼RNA的必要條件，主要原因是許多非編碼RNA在特殊環境條件下表達，它們的啟動子往往是未知的稀有啟動子，而是否所有非編碼RNA都有非Rho因子依賴的終止子也尚未明確。Mentz等［21］以5'端上游存在啟動子作為篩選條件，Yan等［17］以5'端上游存在啟動子或3'端具有非Rho因子依賴的終止子作為篩選條件，他們篩選非編碼RNA的策略準確度比較高，假陽性較少，但可能靈敏度較低，會遺漏某些由未知的稀有啟動子介導轉錄起始的非編碼RNA。

2.3 序列保守性分析

非編碼RNA一級序列在遠親基因組（Distantly related genomes）中的保守性很低［5］，但在同一屬或同一種的不同菌株存在一定的保守性。在鑒定出新非編碼RNA后，研究者通常會利用BLAST、BLAT等工具在近緣物種的基因組中檢測這些非編碼RNA的保守性。通過比較發現的不保守的非編碼序列，經常是在病原細菌中起關鍵作用的非編碼RNA［22］。

2.4 二級結構分析

非編碼RNA的二級結構分析主要包括結構聚類分析、結構保守性分析和結構穩定性分析。結構聚類分析和結構保守性分析具有類似的原理，但側重點有所不同。大部分RNA家族是由相似二級結構來定義的，而家族內通常沒有很強的序列同源性［18］。結構聚類分析通過對非編碼RNA進行結構分析，將這些非編碼RNA進行分類，以加深對其進化關系的認識和理解［18］。LocARNA軟件［32］是完成二級結構聚類分析的重要工具。結構保守性分析是利用基因組數據進行計算機預測發現非編碼RNA的重要原理［5］。研究者認為編碼蛋白的mRNA具有較強的一級序列保守性，而不編碼蛋白的非編碼RNA應該具有較強的二級結構保守性，通過研究近緣物種基因組序列的一級序列保守性和二級結構保守性，可以區分編碼RNA和非編碼RNA。依據此原理，RNAz［33］等軟件被開發出來用以非編碼RNA的預測。Mentz等［21］利用RNAz軟件對谷氨酸棒狀桿菌基因組上的非編碼RNA進行預測，以尋找預測結果與dRNA-seq測序結果發現的非編碼RNA的交集。此外，因為非編碼RNA通常具有穩定的二級結構，有研究者從能量的角度分析非編碼RNA的結構穩定性，如Miotto等［13］分析了非編碼RNA的最小折疊能（Minimum Folding Energy，MFE），Perkins等［34］分析了非編碼RNA的最小自由能（Minimum Free-Energy MFE）。由于目前還未發現普適性的非編碼RNA二級結構特點，因此還難以通過二級結構對測序發現的非編碼RNA進行篩選。

2.5 開放閱讀框分析

測序實驗鑒定出的非編碼RNA也有可能編碼未知短肽鏈，因此有必要對鑒定出的sRNA進行開放閱讀框分析［18，21］。起始密碼子、終止密碼子和核糖體結合序列是開放閱讀框分析的主要依據［18］。GenDB［35］、ORFfinder［36］、Glimmer［37］和GeneMarkHMM［38］等軟件可以幫助研究者對非編碼RNA中的開放閱讀框進行分析。

2.6 非編碼RNA的表達驗證實驗

目前對非編碼RNA表達的驗證以Northern印記雜交和實時定量PCR驗證為主，Northern印記雜交結果比較直觀，而實時定量PCR驗證可快速大批量地對非編碼RNA進行表達量驗證。在測序實驗中，對重點非編碼RNA的實驗方法驗證是必不可少的。

2.7 非編碼RNA靶標或靶功能預測和驗證

靶標分析可以幫助研究者找到在某一生理過程中起重要作用的非編碼RNA，從而確定后續研究的重點對象。靶標的預測主要依據非編碼RNA與靶標的互補配對的特點，目前已有許多非編碼RNA的靶基因預測軟件可以應用，其中TargetRNA［39］的應用最為廣泛。真核生物非編碼RNA，如miRNA的靶標預測往往采用多種不同預測原理的軟件預測后，取結果的交集，而現階段細菌中非編碼RNA靶標的預測多以單一軟件預測結果為準，在這方面應該借鑒真核生物非編碼RNA研究的經驗。對非編碼RNA功能的驗證以定點突變和敲除實驗為主。定點突變可驗證非編碼RNA與靶標基因的結合性與結合位點。敲除實驗則可驗證非編碼RNA在某一生理過程中的調控作用。

3 問題與展望

在RNA-seq和dRNA-seq等技術的幫助下，人類在細菌中發現的非編碼RNA的數量迅速增長，相比之下，經過功能驗證的非編碼RNA卻極為稀少。以單增李斯特菌為例，目前發現的sRNA已有147個（包括LhrA-LhrC、RliA-RliI、RnpB、SsrA、SsrS、SbrA、Rli22-Rli147， 不 計asRNA）［4］， 但目前有文章報道的經過功能驗證的只有LhrA［40］、LhrC［41］和Rli27［42］。大量經測序發現的非編碼RNA主要是通過“來源于基因組上的基因間區或基因互補鏈的對應序列”這一位置標準篩選出來的，這些非編碼RNA是否真正能在細菌中起到調控作用尚不得而知。

目前除了“在基因組上的位置”這一非編碼RNA篩選條件外，難以發現非編碼RNA的其他普適特征，這一瓶頸可能與細菌非編碼RNA的分類不清有關。解決這一問題可采用分而治之的思想。隨著人類對細菌非編碼RNA認識的不斷加深，可能找到某一種類型的非編碼RNA的統一特征，將其特征用于測序實驗結果的非編碼RNA篩選，可以更好地篩選出有特定功能的某一類非編碼RNA。例如，隨著人類對Hfq蛋白與非編碼RNA相互作用的認識不斷加深，可以總結出能與Hfq蛋白結合的RNA的序列或結構特征，以此特征為篩選條件，便可從測序數據中篩選出依賴Hfq蛋白的非編碼RNA。

對細菌非編碼RNA的研究只是研究細菌生理調控的一個方面，單獨的非編碼RNA研究難以對細菌為適應環境而進行的復雜調控有全面的認識，今后的研究應將非編碼RNA測序與單株菌的全基因組重頭測序、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學以及典型特征環境因素相結合，實現多層次多因素的綜合分析，才能更客觀地分析非編碼RNA的特點及功能。多組學綜合分析在真核生物非編碼RNA介導的生理調控的研究中已有應用，在相關領域提出了更完善的生理調控網絡［43］。在原核生物中，研究者往往只將非編碼RNA測序與轉錄組學聯用［18，22］，至于非編碼RNA是否導致蛋白水平、代謝水平的變化還沒有應用組學方法的全面研究。因此，雖然微生物非編碼RNA研究較多地關注了多種環境因素對非編碼RNA表達圖譜的影響，但因缺少蛋白組、代謝組數據的支持，并未真正找到非編碼RNA介導的細菌對環境因素的適應性調控網絡。多組學研究將為探索微生物奧秘的旅程打開嶄新的一扇門。

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Progress in Methodology of Bacterial Noncoding RNA Research Based on High-throughput Sequencing

Guo Mingzhang Xu Wentao
（Laboratory of Food Safety and Molecular Biology，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）

Bacterial noncoding RNA refers to the nucleic acid molecules that do not encode proteins, but play roles in the regulation in the form of RNA in bacteria. Application of high-throughput sequencing technology has greatly advanced the discovery of non-coding RNA in a variety of bacterial species. However, due to the lack of enough knowledge on the characteristics of non-coding RNA in bacteria, the bioinformatics analysis of the sequencing data are still defective. This article describes two main techniquesthat applied high-throughput sequencing to be used in the researches on bacterial non-coding RNA：RNA-seq and dRNA-seq. The existing bioinformatics methods for screening of non-coding RNA are reviewed, and the recommendations for improving the bioinformatics strategy in this field are proposed.

bacteria；non-coding RNA；high-throughput sequencing；bioinformatics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.015

2015-03-29

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃，2012AA101606），北京市科技新星計劃（XX2014B069）

郭明璋，男，博士研究生；E-mail：guomingzhang126@126.com

許文濤，男，副教授，博士生導師，研究方向：食品病原微生物的檢測技術和致毒機制研究、轉基因生物檢測和食用安全性評價研究、食品源風險因子對腸道微生物健康的影響等；E-mail：xuwentao1111@sina.com