補腎化痰法影響骨髓間充質干細胞成骨分化的實驗研究*

周亞娜，向 楠，陳 輝

(1．湖北省中醫院，武漢 430061;2．湖北中醫藥大學，武漢 430065)

補腎化痰法影響骨髓間充質干細胞成骨分化的實驗研究*

周亞娜1，向 楠2△，陳 輝2

(1．湖北省中醫院，武漢 430061;2．湖北中醫藥大學，武漢 430065)

目的:研究補腎化痰法對BMSCs成骨分化的影響，探討補腎化痰法治療骨質疏松癥的可能作用機制。方法:運用全骨髓貼壁法分離培養純化Wsitar大鼠BMSCs，誘導BMSCs成骨分化，觀察補腎中藥、化痰中藥和補腎化痰中藥分別對BMSCs成骨分化后茜素紅染色及定量、堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OCN)mRNA表達影響。結果:補腎化痰中藥能促進BMSCs成骨誘導后細胞體外鈣化，提高細胞內ALP活性，上調OCN-mRNA表達。結論:補腎化痰法可以促進BMSCs向成骨細胞分化。

補腎化痰法;骨質疏松癥;骨髓間充質干細胞;成骨分化

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

L-DMEM，美國Hyclone公司;胎牛血清(FBS)，澳大利亞 Maverick公司;CD29-FITC、CD45-PE、CD44-FITC，美國 BioLegend公司;二甲基亞楓(DMSO)、地塞米松(DEX)、維生素C、β-甘油磷酸鈉(β-GP)，Invitrogen公司;RT-PCR 試劑盒，Fermentas公司;堿性磷酸酶染色液(BCIP/NBT)，美國Maxim Biotech公司;蛋白定量的試劑盒(lowry 法)，Bio Rad公司;FACSCalibur型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)、PCR擴增儀(Biometra公司)、紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 中藥干預液的配制

補腎化痰中藥組:淫羊藿、補骨脂、全栝樓、紅曲、山楂;補腎中藥組:淫羊藿、補骨脂;化痰中藥組:全栝樓、紅曲、山楂。將上述各組中藥復方經水煮、醇沉，濃縮成每毫升相當于原中藥材1 g的藥液，4℃冰箱保存備用。用前先用濾紙初濾，再用0.22 μm過濾除菌、分裝，－20℃保存。

1.3 BMSCs分離、培養與傳代

全骨髓貼壁法:6～8周齡雄性Wistar大鼠，分離大鼠兩側股骨和脛骨，用含10%FBS的L-DMEM完全培養基反復沖洗骨髓腔，將細胞懸液移至離心管，200 g離心5 min棄上清。用2～3 ml的 LDMEM完全培養基(含L-DMEM培養基，10%FBS，青霉素、鏈霉素各100 U/ml)重懸細胞，接種到T25塑料培養瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。72 h后首次全量換液，棄去未貼壁細胞。此后每3 d更換培養基，待細胞80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.4 BMSCs鑒定

形態學觀察，即逐日用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。BMSCs表面標志物的測定，即用流式細胞儀檢測P4代BMSCs表面CD29、CD44和CD45單克隆抗體表達。

打開國家工商行政管理總局商標局的中國商標網，在相似商標國際分類第一類中，隨意輸入國內一線的化肥商標，就可以查詢出諸多相似商標，多數僅一字之差。記者以“紅四方”商標為例，查詢時發現，與之一字之差的商標還有“四方”“四紅方”“紅方”“紅遍四方”等多個與之類似的商標，這些商標多數用于化肥行業。除了“四紅方”與“紅四方”的申請人均為中鹽安徽紅四方股份有限公司外，其他相似商標的申請人則是不同的公司和個人。再以“史丹利”進行搜索，則發現一字之差的商標依舊很多，如“史丹臣”“史沛利”“綠丹利”等，這些商標均屬于不同公司。

1.5 補腎化痰中藥對BMSCs誘導成骨分化的影響

將P4代BMSCs按4×103/cm2密度接種于6孔板，細胞融合達60%～70%后加入成骨分化培養基(含10－7mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 μg/ml Vitamin C)，置培養箱中隔天換液1次。根據預實驗結果，在成骨分化誘導培養基中分別加入0.01%補腎化痰中藥干預液、補腎中藥干預液、化痰中藥干預液，分為補腎化痰中藥組、補腎中藥組、化痰中藥組。BMSCs成骨誘導18 d后終止誘導，并進行下列各項指標檢測。

1．5．1 茜素紅染色及定量 用10%中性甲醛固定15min，加入0.5%的茜素紅染色液染色20 min，蒸餾水洗滌4次，分光光度法測定吸光度(OD 值)，茜素紅定量以umol/mg表示。

1．5．2 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測 用常規生化分析儀測定ALP活性。

1．5．3 骨鈣素(OCN)mRNA表達 用0.25%胰蛋白酶(含1mmol/L EDTA)消化收集細胞，按照Trizol試劑盒說明進行總RNA的抽提。引物設計: β-actin，上游引物:5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’;下游引物:5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’。OCN:上游引物:5’-ATG AGA GCC CTC ACA CTC-CTC-3’，下游引物:5’-GCC GTA GAA GCG CCG ATA GGC-3’。經逆轉錄反應制備cDNA后貯于－20℃備用。PCR體積30 μL，包括cDNA模板1.2 μL，10×Buffer 3 μL，dNTP (0.2 mM)3 μL，MgCl2(25 mM)2 μL，上游引物:(10 μM)1 μL，下游引物:(10 μM)1 μl，Taq酶(1 U/ μL)2 μL，ddH2O補足體積至30 μL。混勻后離心數秒，置PCR儀上，熱循環程序為:預變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火60℃1 min，延伸72℃1 min，30個循環后72℃再延伸10 min。取10 μL產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統檢測溴化乙錠染色的凝膠，紫外燈下觀察，凝膠成像系統掃描存盤。記錄各條帶積分光密度(IOD)，將檢測基因與GAPDH條帶IOD相比較得到其相對IOD。

1.6 統計學方法

采用SPSS 12.0統計軟件對實驗數據進行分析，所有數據以均數±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs及成骨誘導分化后形態學特征

接種后，BMSCs呈圓形，胞體透亮，折光性強，大小不一。72 h首次換液后即可見大量貼壁細胞，細胞完全舒展并呈現長梭形、三角形、多邊形等多種形態，帶2～3個突起。4～7 d呈放射狀生長的貼壁細胞形成數個不同大小、分散的細胞集落。9～10 d細胞逐漸融合成片，沿胞體長軸有序排列，呈旋渦狀(圖1)。傳代后的細胞形態單一均勻，融合后呈典型的極性，漩渦狀生長。成骨誘導第2天開始，即可見部分細胞由長梭形逐漸變為立方形，進而轉變為多角形且體積增大。培養8 d后，細胞持續增殖，呈多層重疊生長，逐漸聚集形成多個散在致密的島狀細胞結構，并逐漸被細胞分泌的基質所包埋，13 d左右出現鈣化結節，其后還可見到明顯的鈣沉積(圖2)。

圖1 BMSCs原代培養結果(×40)

圖2 BMSCs傳代培養(×200)

2.2 大鼠BMSCs表面標志物檢測

細胞表面抗原CD29、CD44的陽性率分別為99.64%和98.52%，CD45的陽性率為1.54%。

2.3 補腎化痰方對BMSCs成骨誘導后茜素紅S染色與定量、ALP活性、OCN-mRNA表達的影響

表1圖3顯示，用茜素紅S染色后礦化結節呈橘紅色。各組OCN-mRNA表達的電泳圖，見圖4。補腎化痰中藥組BMSCs成骨誘導后茜素紅S定量值、ALP活性、OCN-mRNA表達均高于經典誘導組(P＜0.05，P＜0.001)。補腎中藥組和化痰中藥組與經典誘導組比較，差異均無統計學意義。

圖3 細胞礦化作用檢測結果(×200)

圖4OCN-mRNA瓊脂糖電泳結果

表1 各組BMSCs成骨誘導后茜素紅定量、ALP活性及OCN-mRNA表達的檢測結果(n=3±s)

表1 各組BMSCs成骨誘導后茜素紅定量、ALP活性及OCN-mRNA表達的檢測結果(n=3±s)

注:與經典誘導組比較:*P＜0.05，＊＊＊P＜0.001

組別 茜素紅定量(μmol/mg)-actin經典誘導組ALP活性(nmol/mg) OCN/β 12.605±0.847 3406.650±5．734 0.384±0.131補腎化痰中藥組 15.568±2.310*4265.287±41．735＊＊＊1.080±0.356＊＊＊補 腎 中 藥 組 11.277±0.489 3580.569±8．797 0.588±0.327化 痰 中 藥 組12.626±1.221 3044.010±5．581 0.549±0.079

3 討論

BMSCs是在骨髓中發現的一種起源于中胚層、具有自我復制和多向分化潛能的非造血干細胞，能在不同的誘導條件下分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、肌肉細胞、心肌細胞、血管內皮細胞等成熟的間質細胞［2］。BMSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化保持正常的比例關系，對維持骨組織重建與代謝發揮著重要的調控作用。一旦BMSCs過多地向成脂細胞方向分化，則向成骨細胞分化的細胞數就相應減少，進而引起成骨缺陷。研究表明，各種原因導致的骨質疏松和骨量減少，如卵巢切除、長期制動、酒精、糖皮質激素應用等，多伴有骨髓脂肪細胞的增多［3］。隨著年齡的增長，骨量不斷丟失的同時，骨髓腔內脂肪細胞的體積、數目均呈直線性增加［4］，尤其是四周骨髓的骨髓腔約90%被脂肪細胞占據。絕經后骨質疏松婦女的BMSCs成骨分化能力減弱，更易于向脂肪細胞分化［5］。因此，研究調控BMSCs向成骨細胞方向分化、抑制向脂肪細胞分化的基因及藥物是骨質疏松癥防治的重要方向。

我們從脂代謝紊亂與骨質疏松癥存在密切聯系出發，認為腎虛是骨質疏松癥的病理基礎，痰濁是骨質疏松癥的致病因素之一，提出脂代謝異常可能與骨質疏松癥痰濁有關的假說，并制定了補腎化痰的新治則［6］。補腎化痰方由淫羊藿、補骨脂、全栝樓、山楂、紅曲5味藥組成。方中淫羊藿，《本草綱目》稱其有“益精氣，強筋骨，補腰膝”作用，為溫腎壯陽之要藥;補骨脂具有補腎壯陽、固精縮尿、溫脾止瀉的功效，兩藥相合補腎壯骨，是為君藥。方中全栝樓功可清熱化痰為臣藥;山楂善于消食化積、行氣散瘀;紅曲健脾消食、活血化瘀，二藥協同為佐藥，全方共奏補腎化痰之功。

成骨細胞在鈣化條件培養下，具有體外礦化特點，用茜素紅S染色可見橘紅色鈣結節，可作為成骨細胞的一種標志。ALP是一種較為肯定的參與促進鈣化活動的酶類，它是一種細胞內酶，其活性作為早期成骨性分化指標在骨代謝研究中被廣泛應用。OCN是晚期成骨性誘導的關鍵性標志，對骨骼的改建過程有重要的調節功能。本實驗結果表明，補腎化痰中藥組BMSCs成骨誘導后茜素紅S定量值、ALP活性、OCN-mRNA表達均高于經典誘導組，而補腎中藥組和化痰中藥組與經典誘導組比較差異均無統計學意義，提示補腎化痰中藥在促進BMSCs早期和晚期成骨性分化方面均具有作用。

［1］ Kha HT，Basseri B，Shouhed D，et al．Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells:probone and antifat ［J］．J Bone Miner Res，2004，19(5):830．

［2］ MingueU JJ，Erices A，Conget P．Mesenchymal stem cells［J］．Exp Biol Med，2001，226(6):507-520．

［3］ 郭坤亮，安洪，蔣電明，等．早期酒精性股骨頭缺血壞死骨細胞凋亡的實驗研究［J］．重慶醫科大學學報，2003，28(3): 313-315．

［4］ 李湘輝，陸志堅，張金超，等．阿倫磷酸鈉對小鼠骨髓基質細胞成骨和成脂分化的影響［J］．中國藥理學報，2006，22(6): 671-674．

［5］ Rodriguez JP，Garat S，Gajardo H，et al．Abnormal osteogenesis in osteoporotic patients is reflected by altered mesenchymal stem cells dynamic［J］．J Cell Biochem，1999，75(3)414-423．

［6］ 周亞娜，向楠．從“痰”論治骨質疏松癥［J］．湖北中醫雜志，2013，35(12):36-38．

Experimental study of tonifying kidney and resolving phlegm methods on influencing the bone marrow mesenchymal stem cells osteogenic differentiation

ZHOU Ya-na1，XIANG Nan2△，CHEN Hui2
(1．Hubei provincial hospital of TCM，Wuhan 430061，China;2．Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China)

Objective:It observed the osteoblastic differentiation of BMSCs on Bushen Therapy，Huatan Therapy，Bushen Huatan Therapy，and explore the mechanism of Bushen Huatan Therapy of treating osteoporosis．Method:BMSCs of wistar rats were isolated，purified by using whole bone marrow adherent method and identified by cytomorphology and morphologic characteristics，surface antigensdetected by flow cytometer．BMSCswasinduced by osteoblastic differentiation．Through the detection of alizarin red staining and quantitative，the ALP activity and the expression of OCN-mRNA，it explored the effect of osteoblastic differenttiation of BMSCs on Bushen Therapy，Huatan Therapy，Bushen Huatan Therapy．Results:Using the whole bone marrow adherent method can get good，stable and heterogeneity of BMSCs．Bushen Huatan Herb can promote BMSCs to generate into osteoblast in vitro calcification，increase the activity of ALP，down-regulate theexpression ofOCN-mRNA．Conclusion: Bushen Huatan Treatmentcan promote osteoblastic differentiation of BMSCs．

Bushen Huatan Treatment;Osteoporosis;Bone mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation

R274．9

B

1006-3250(2015)03-0275-03

2014-11-16

國家自然科學基金資助項目(30672591);湖北省自然科學基金資助項目(2007ABA237)。

周亞娜(1980-)，女，湖北襄陽人，主治醫師，醫學博士，從事中西醫結合內分泌代謝疾病和內分泌腫瘤的臨床與研究。

△通訊作者:向 楠，教授，博士研究生導師，第一批全國中醫藥優秀臨床人才，全國老中醫經驗繼承人，Tel: 13007162959，E-mail:xiangnan61@sina．com。