川芎嗪對乏氧人肺癌細胞β1-整合素及鈣依賴黏附素表達的影響*

任為民，張培彤，張明輝

(1．河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004;2．中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

川芎嗪對乏氧人肺癌細胞β1-整合素及鈣依賴黏附素表達的影響*

任為民1，2，張培彤2△，張明輝2

(1．河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004;2．中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

目的:探討川芎嗪對乏氧人巨細胞肺癌(PG)細胞表達β1-整合素和鈣依賴黏附素的影響。方法:PG細胞復蘇，分為川芎嗪高、中、低劑量組及順鉑組、陰性對照組，置常氧和低氧環(huán)境培養(yǎng)，檢測E-cadherin(CD324)、β1-整合素(CD29)的表達。結果: PG細胞CD324常氧組表達大于低氧組;在常氧和低氧環(huán)境中，各實驗組CD324表達均大于對照組;常氧組CD29表達低于低氧組。結論:在乏氧環(huán)境下PG細胞有更高的轉移能力，川芎嗪能夠抑制PG細胞的轉移能力。

人巨細胞肺癌細胞;川芎嗪;β1-整合素;鈣依賴黏附素

細胞間黏附分子表達的異常與腫瘤轉移密切相關。整合素β-catenin表達的上調(diào)有利于腫瘤細胞的侵襲和轉移［1］。鈣相關黏附素E-cadherin失活變異則促進腫瘤轉移［2］。組織微環(huán)境缺氧通過上調(diào)β-catenin、下調(diào)E-cadherin增強腫瘤細胞的轉移能力［3］。本實驗利用川芎嗪(TMP)干預常氧、低氧微環(huán)境下生長的人高轉移性巨細胞肺癌(PG)細胞，通過流式細胞術檢測 PG細胞表面 E-cadherin (CD324)及β1-整合素(CD29)表達的變化來研究川芎嗪對PG細胞轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株

PG細胞由中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院腫瘤實驗室提供。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基:GIBCO;胎牛血清(FBS):中國杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶(Trypsin):Amresco產(chǎn)品;鹽酸川芎嗪:中國藥品生物制品檢定所提供，批號 110817-200305;順鉑(DDP):云南個舊生物藥業(yè)有限公司，批號090911; PE anti-human CD324(E-Cadherin):美國Biolegend; PE Mouse IgG1，κIsotype Ctrl(FC):美國Biolegend; PE MouseAnti-Human CD29:美國 BD;PE Mouse IgG2a，κIsotype Control:美國Milipore。CO2細胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱:日本Sanyo公司;低氧工作站INVIVO2200:英國RUSKINN公司;超凈工作臺:北京長城空氣凈化工程公司;電子天平:Saitorius BS400S，北京賽多利斯天平有限公司;可調(diào)式微量加樣器:德國Eppendorff公司;TE200-U熒光倒置顯微鏡:日本Nikon。

1．3 方法

1．3．1 細胞培養(yǎng) 常規(guī)復蘇PG細胞，用含有10%FBS、10萬u/L青霉素、10萬u/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，分別置于常氧環(huán)境(CO2培養(yǎng)箱: 5%CO2、95%空氣)、低氧環(huán)境(低氧工作站:5% O2、5%CO2、90%N2)傳代培養(yǎng)。

1．3．2 流式細胞儀檢測PG細胞CD324、CD29表達 取常氧和乏氧培養(yǎng)對數(shù)生長期的PG細胞，胰酶消化，以1×105/ml的密度懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基，待細胞貼壁后分別加入以 10%FBSRPMI1640培養(yǎng)液配制的鹽酸川芎嗪(TMP)，使其終濃度分別為 240 μg/ml(TMPH)、120 μg/ml (TMPM)、10 μ g/ml(TMPL)。同時設陰性對照組(Control，只加細胞和培養(yǎng)液)、順鉑組(DDP，2 μg/ ml)作為陽性對照，分別置常氧和低氧培養(yǎng)48 h，各組PG細胞用胰酶消化，以PBS液(pH 7.4)吹打收集細胞，再以PBS洗2遍，復懸于PBS溶液中(1× 106cells/100 μL)。加入流式上樣管，每管100 μL，每組分設實驗管和同型對照管，實驗管分別加入CD29 PE(20 μL)、CD324 PE(20 μL)，同型對照分別加入PE Mouse IgG2a、κ Isotype Control(20 μL)、PE Mouse IgG1、κ Isotype Ctrl(20 μL)，37℃避光孵育30 min，PBS洗2遍，過200目尼龍篩網(wǎng)，每個實驗重復3次，每個樣品收集104個細胞。測定采用美國BD公司出品的FACS Calibur分析型流式細胞儀。機器測試條件為FSC電壓E-1，增益6.14，線性;SSC電壓320mv，增益1.00，線性;FL1電壓400 mv，對數(shù);FL2電壓340 mv，對數(shù);激光功率15 mv，激發(fā)光波長488 nm。校正機器后，先以前向角和側向角散射光形成的細胞散點圖設定收集門，以固定條件收集樣本。每個樣品管收集104個腫瘤細胞后進行分析，采用Macintosh Quadra 650計算機和Cell Quest軟件收集處理樣品數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并得出結論。

1．3．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測常氧和低氧培養(yǎng)PG細胞CD324表達情況

表1圖1顯示，在常氧和低氧環(huán)境中，各試驗組PG細胞 CD324表達陽性率均大于對照組(P＜0.05)。

表1 PG細胞CD324的表達(±s)

表1 PG細胞CD324的表達(±s)

注:與control比較:aP＜0.05，aaP＜0.01

藥物 藥物濃度(μg/ml)常氧熒光強度TMP 240 57.80±13.86aa11.52±2.74 32.82±15.49aa低氧表達陽性率(%) 熒光強度 表達陽性率(%) 16.58±6.96 TMP 120 49.66±16.55aa11.42±1.01 40.60±21.56aa14.74±6.19 TMP 10 41.70±19.02a11.62±2.16 25.11±14.39a14.39±7.10 DDP 2 44.31±14.81aa16.70±5.06 34.44±17.56aa20.00±7.28 Control — 20.79±11.05 11.52±2.74 9.16±8.16 16.01±9.13

圖1 PG細胞CD324表達情況(N常氧，H低氧)

2.2 流式細胞術檢測常氧和低氧培養(yǎng)PG細胞CD29表達

表2圖2顯示，PG細胞CD29在常氧和低氧微環(huán)境中各組的表達陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但常氧對照組CD29表達的平均熒光強度低于低氧對照組(P＜0.01)。

3 討論

β1整合素介導細胞與細胞、細胞與基質之間的黏附反應與肺癌轉移關系密切［4］。鈣相關黏附素(CD324)表達缺失，與人類肺癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌的轉移密切相關［5］。肺癌患者存在血瘀證，晚期病人更為明顯［6］。血瘀證存在微循環(huán)障礙和組織缺氧的病理改變［7］，而組織微環(huán)境缺氧可通過調(diào)控癌細胞缺氧誘導因子HIF-1α基因，進而影響細胞E-cadherin和 β1-catenin分布，并促進癌細胞的遷移、浸潤和與血管內(nèi)皮細胞的黏附［8］。本研究結果顯示，細胞乏氧導致PG細胞CD324表達陽性率下調(diào)，同時CD29表達上調(diào)。據(jù)此我們推斷，在乏氧環(huán)境下PG細胞有更高的轉移能力，這與臨床上晚期肺癌病人血瘀證增加的觀察結果相符。

表2 PG細胞CD29的表達(±s)

表2 PG細胞CD29的表達(±s)

注:與常氧時比較:bbP＜0.01

藥物 藥物濃度(μg/ml)低氧表達陽性率(%) 熒光強度 表達陽性率(%)常氧熒光強度TMP 240 99.28±0.32 78.47±22.81 99.34±0.55 134.30±32.61 TMP 120 99.58±0.28 82.82±18.04 98.44±1.25 118.75±40.62 TMP 10 99.35±0.45 64.22±28.66 99.04±0.67 127.79±30.50 DDP 2 98.95±0.66 80.98±36.03 98.24±1.34 129.10±26.10 Control — 99.25±0.46 73.22±23.78 99.13±0.71 101.15±39.53bb

圖2 PG細胞CD29表達情況(N常氧，H低氧)

川芎嗪是活血藥川芎的主要成分。韓子敏等研究證明，黃芪、川芎嗪能夠抑制腎癌轉移［9］。陳少賢等發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠減輕肺癌患者高凝狀態(tài)，達到抗腫瘤轉移的作用［10］。試驗證明，TMP能抑制小鼠Lewis肺癌的生長與轉移［11］，還可明顯抑制人肺巨細胞癌細胞(PG)與內(nèi)皮細胞的黏附［12］以及對Boyden小室的侵襲［13］。本實驗結果顯示，在常氧和低氧環(huán)境中，川芎嗪能上調(diào) PG細胞 E-cadherin (CD324)的表達，表明川芎嗪能夠通過調(diào)控腫瘤轉移相關黏附分子抑制肺癌的轉移。

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Effect of Tetramethylpyrazine on Expression of β1-integrin and E-cadherin on the Surface of Cell PG in Hypoxic Environment

REN Wei-min1，2ZHANG Pei-tong2△，ZHANG Ming-hui2
(1．Henan Province Chinese medicine research institute，Zhengzhou，Henan 450004，China; 2．Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Objective:To investigate the effect of Tetramethylpyrazine(TMP)on the expression of β1-integrin(CD29) and E-cadherin(CD324)on the surface of cell PG cultured during normoxia and hypoxia．Methods:The revival cell PG was divided into three dosages(high，medium and low)group of Tetramethylpyrazine，DDP group and negative control group．All of five groups were cultured separately in the normal and hypoxic environment．The expression of CD324 and CD29 on the surface of PG cell were detected by the flow cytometry 48 h later．Results:The positive rate of PG cells’CD324 expression of normal oxygen group is higher than hypoxic group(P＜0.01)．In normoxic and hypoxic microenvironment，the expression rate of all experimental group is higher than control group(P＜0.05)．The intensity of PG cells’CD324 expression of normal oxygen group is lower than hypoxic group(P＜0.01)．Conclusion:PG cells have a higher metastatic ability in the hypoxic microenvironment．In the normoxic and hypoxic microenvironment，tetramethylpyrazine can inhibit metastasis ability of PG cells through regulating the metastasis-associated adhesion molecules．

PG cell;Tetramethylpyrazine;β1-integrin;E-cadherin

R734．2

B

1006-3250(2015)03-0291-03

2014-12-24

國家自然科學基金面上項目(30873334)

任為民(1972-)，男，河南鄭州人，主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事中西醫(yī)結合腫瘤學的臨床與研究。

△通訊作者:張培彤，男，安徽人，主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，博士研究生導師，從事中西醫(yī)結合腫瘤學研究，E-mail: zhangpeitong@sohu．com。