氧化苦參堿對酸中毒兔右心室流出道心肌細胞跨膜電位的影響*

王雪芳，劉艷明

(1．河北北方學院，河北張家口 075000;2．中國人民解放軍251醫院心內二科，河北張家口 075000)

氧化苦參堿對酸中毒兔右心室流出道心肌細胞跨膜電位的影響*

王雪芳1，劉艷明2

(1．河北北方學院，河北張家口 075000;2．中國人民解放軍251醫院心內二科，河北張家口 075000)

目的:研究氧化苦參堿對家兔離體右心室流出道心肌細胞跨膜電位的影響及其對該部位自律性異常的調節作用。方法:玻璃微電極細胞內記錄離體家兔右心室流出道自律細胞，觀察氧化苦參堿對右心室流出道細胞跨膜電位的影響，以及氧化苦參堿對模擬酸中毒條件(pH6.9)引發右心室流出道心肌細胞跨膜電位各項指標改變的影響。結果:在模擬酸中毒(pH6.9)灌流時，右室流出道細胞APD50、APD90均明顯縮短，VDD、Vmax和RPF顯著變慢;用不同劑量氧化苦參堿(25、50、100μmol/L)灌流，出現劑量依賴性APD50、APD90的延長，VDD與RPF進一步減慢，以大劑量組氧化苦參堿影響作用最為明顯。結論:提示氧化苦參堿對酸中毒導致的家兔右心室流出道慢反應自律細胞跨膜電位改變所誘發的心律失常有明顯的保護作用。

氧化苦參堿;右心室流出道;酸中毒;跨膜電位

臨床研究發現，室性期前收縮和特發快速性室性心動過速的發生常與右心室流出道結構和功能異常有關，心室流出道曾被認為僅是血液的流出通路。我們前期研究發現，哺乳類動物心室流出道是由動脈球進化而來，是位于心室后相對獨立的功能單位，具有獨立的跨膜電位特征［1］。酸堿失衡是導致心律失常發生的常見原因，機體酸中毒后心肌細胞往往出現繼發性缺血缺氧［2］，導致心室流出道細胞功能和結構形態異常，從而誘發惡性心律失常。中藥苦參是豆科槐屬植物苦參的干燥根，其味苦、性寒，在《本草經百種錄》中有“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦參專治心經之火”的記載，其對多種原因導致的心律失常均有良好的防治效果［3］。研究表明，氧化苦參堿是苦參的主要有效成分之一，具有一定的抗心律失常作用，但其作用機制尚不明確。本實驗應用常規細胞內玻璃微電極記錄手段，研究氧化苦參堿對酸中毒家兔離體右心室流出道自律細胞跨膜電位的影響作用，對臨床應用氧化苦參堿治療心律失常，發掘中醫藥治療優勢具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

1.5 ～2.0 kg家兔，雌雄均可，由中國醫科院動物研究所提供;氧化苦參堿購自寧夏紫荊花藥業有限公司生產(批號20070506);胺碘酮購自珠海潤都制藥股份有限公司(批號H20045108);配制臺式灌流溶液(KCl 4 mmol/L，NaCl 130 mmolL/L，CaCl22.5 mmol/L，MgSO40.5mmol/L，NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO320 mmolL/L，葡萄糖6 mmol/L，pH7.2)僅當天使用。

1.2 主要儀器

RM-6280C型多道生理信號采集處理系統，成都儀器廠生產;DWF-3型微電極放大器，軍事醫學科學院實驗儀器廠生產;SS-202J型隔離器，成都儀器廠生產;SDQ-4型三道電子刺激器，蚌埠實用技術研究所生產;上海精科雷磁pHS-3C酸度計。

1.3 方法

1.3.1 標本制備 家兔擊顱致昏，用開胸器在家兔4、5肋間迅速取出心臟，從主動脈用一次性注射器將臺式液快速注入，沖洗殘留血液。肺動脈后、右瓣之間切開動脈壁，向左下將右心室壁剪開，三瓣膜保留完整，向下取含右心室流出道部位長約4 mm組織。制好的右心室流出道標本用大頭針固定灌流槽內，用臺式液以15 ml/min進行勻速灌流，灌流液充體積分數為96%O2和4%CO2，溫度維持在(35± 0.5℃)。標本在臺式液中穩定20 min后實驗。

1.3.2 電位記錄和參數確定 玻璃微電極內注入3 mol/L KCL充當電極液。微電極緩慢固定于右心室流出道自律細胞內，記錄動作電位，穩定15 min開始實驗。由玻璃微電極引導出動作電位，經微電極放大器擴大輸入計算機記錄，同時分析跨膜動作電位各項參數。實驗分為4組:正常對照組正常臺式液灌流;模型對照組用乳酸鈉調節酸度，酸度計測量至pH6.9灌流;對照藥物組造模同模型組，以胺碘酮(25 μmol/L)灌流;氧化苦參堿組造模同模型組，分別以小中大劑量氧化苦參堿(25、50、100 μmol/L)灌流。

觀察跨膜動作電位:復極50%和90%時間(50%and 90%of duration of action potential，APD50and APD90)，4相自動除極速率(velocity of diastolic depolarization，VDD)，自發放電頻率 (rateof pacemaker firing，RPF)，動作電位幅值(amplitude of action potential，APA)，0相最大除極速率(maximal rate of depolarization，Vmax)。

1.3.3 實驗流程 玻璃微電極穩定在右心室流出道慢反應自律細胞上15 min右右，記錄正常的跨膜電位，依次加入濃度不同的氧化苦參堿灌流液并記錄數據。用正常臺式灌流液沖洗20 min后，然后用模擬酸中毒臺式液(KCl 4 mmol/L，NaCl 130 mmolL/L，CaCl22.5 mmol/L，MgSO40.5 mmol/L，NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO312 mmol/L，乳酸鈉20 mmolL/L，pH6.9)、用乳酸鈉調節臺式液pH值達6.9(此值是在心肌缺血、梗死局部內環境中常見的［2］)灌流，記錄參數變化;穩定10 min后用胺碘酮(25 μmol/L)灌流，記錄跨膜電位各項參數變化;正常臺式灌流液沖洗20 min后，待各項參數基本恢復;用乳酸鈉調節臺式液酸度，造模同模型組，依次用含有不同濃度氧化苦參堿的臺式液灌流(25、50、100 μmol/L)，記錄不同濃度氧化苦參堿對酸中毒家兔離體心肌細胞跨膜電位的影響。

1.3.4 統計學方法 應用Excel軟件進行數據統計分析，跨膜動作電位各觀察數據以均數±標準差(±s)表示，給藥前后各項指標采用自身配對t檢驗。

2 結果

2.1 氧化苦參堿對家兔離體右心室流出道自律細胞跨膜電位的影響作用

表1顯示，右心室流出道慢反應自律細胞APD50、APD90明顯縮短(P＜0.05)，VDD變慢(P＜0.05);Vmax變快(P＜0.05);大劑量組RPF顯著變慢(P＜0.01)，具有明顯的劑量依賴性。

2.2 氧化苦參堿對酸中毒家兔離體右心室流出道自律細胞跨膜電位的影響

表2顯示，氧化苦參堿小劑量組與酸中毒對照組比較，各項指標比較差異無統計學意義(P＞0.05);氧化苦參堿中等劑量組顯示，右室流出道細胞RPF進一步變慢(P＜0.05);氧化苦參堿大劑量組顯示，右室流出道細胞APD50、APD90均明顯延長(P＜0.05)，RPF與酸中毒組比較顯著變慢(P＜0.01)。

表1 氧化苦參堿對家兔離體右心室流出道心肌細胞跨膜電位的影響作用(±s)

表1 氧化苦參堿對家兔離體右心室流出道心肌細胞跨膜電位的影響作用(±s)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 家兔數 APD50(ms) APD90(ms) VDD(mV/s) RPF(beats/min) APA(mV) Vmax(V/s)正 常 對 照 組 10 116.36±13.48 209.48±26.36 35.54±3.96 128.15±18.25 56.16±5.12 9.05±0.74氧化苦參堿組(25μmol/L) 10 116.32±14.74 199.54±18.34 33.56±4.68 112.79±11.46 51.57±6.46 9.46±0.77氧化苦參堿組(50μmol/L) 10 109.58±14.86 195.25±11.34 31.34±4.66 82.62±34.66* 50.65±5.78 9.43±0.58氧化苦參堿組(100μmol/L) 10 106.57±11.46*190.55±16.73* 29.56±3.44* 71.71±12.62＊＊49.67±5.29* 10.28±0.91*

表2 氧化苦參堿對酸中毒家兔離體右心室流出道心肌細胞跨膜電位的影響作用(±s)

表2 氧化苦參堿對酸中毒家兔離體右心室流出道心肌細胞跨膜電位的影響作用(±s)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與對照藥物組比較:△P＜0.05

組別 家兔數 APD50(ms) APD90(ms) VDD(mV/s) RPF(beats/min) APA(mV) Vmax(V/s)正 常 對 照 組 10 118.63±15.29 216.13±35.34 34.66±4.46 126.29±20.22 51.66±6.37 8.93±1.04模 型對照組(pH 6.9) 10 96.47±11.58*188.23±31.47* 27.43±3.96* 101.34±17.13＊＊41.38±5.32* 6.02±0.87＊＊對照藥物組(25 μmol/L) 10 121.63±15.29#245.46±27.61# 24.68±3.58# 79.58±11.67## 47.63±4.55# 7.45±0.64#氧化苦參堿組(25μmol/L) 10 97.17±10.38 189.68±21.11 27.14±5.24 99.36±13.33 41.06±7.58 7.13±0.48氧化苦參堿組(50μmol/L) 10 99.59± 9.86 191.79±18.54 25.58±3.47 92.66±20.37#△44.25±4.89 7.69±0.53氧化苦參堿組(100μmol/L) 10 107.58±16.23#△205.23±32.23#△20.96±4.36#△ 87.26±17.23##△49.14±4.26#△ 7.99±0.42#△

3 討論

氧化苦參堿是中藥苦參的主要有效成分。國內研究證明，氧化苦參堿具有明顯的抗心律失常作用［4］。中醫史典籍早有苦參“苦入心，寒除火”的記載，故苦參專治“心經之火”。其機制可能與其影響鈉離子通道(INa)、抑制ATP敏感性鉀離子通道的活性與促進電壓依賴性鈣離子通道的開放有關［5］。INa是影響心肌傳導性、舒張期去極化速率和興奮性的重要離子流。0相去極化是由Na+的快速內流所形成，這種細胞膜電位的急劇變化在心室肌可觸發興奮的傳導和肌肉的收縮。氧化苦參堿可以顯著延長心肌有效不應期，增加心肌細胞舒張期興奮閾值［6］。研究發現，急性心肌梗死、心肌缺血局部環境出現酸中毒時細胞內pH值下降和胞內酸化。酸中毒的同時伴發心肌細胞明顯的電生理改變，細胞內氧分壓降低，心肌細胞內ATP逐漸耗竭，與此同時細胞內Na+、Ca2+的濃度增加，L型鈣離子通道開放時程縮短，閉合時間加長［7］。同時發現，右心室流出道慢反應自律細胞動作電位呈現多種形態，即具有明顯的電生理異質性［8］。我室對右心室流出道慢反應自律細胞跨膜離子流基礎進行研究發現，其與竇房結起搏細胞類似，右心室流出道慢反應自律細胞跨膜動作電位0期去極化離子流主要為鈣離子內流和少量鈉離子內流，復極化過程中起主導作用的是外流的鉀離子，4期自動除極化主要是ICa-L參與和進行性衰減的鉀離子外流存在［9］。臨床研究發現，機體電解質紊亂、心肌細胞酸中毒缺氧以及藥物等因素均是心肌細胞發生電生理異質性的誘發因素，同時可導致嚴重的特發性室性心律失常。而提高細胞舒張期興奮閾值，能降低心肌細胞自律性，減少觸發活動，延長有效不應期，可使折返落入有效不應期而終止心律失常［10-11］。

從本實驗結果來看，用模擬酸中毒臺式液灌流家兔右心室流出道組織后VDD和RPF明顯減慢，并隨著時間的延長有心律不規則現象發生;用中等劑量氧化苦參堿灌流后顯示，右室流出道細胞RPF進一步變慢;用氧化苦參堿大劑量組灌流后顯示，右室流出道細胞APD50、APD90均明顯延長，VDD、Vmax和RPF顯著變慢，且心律逐漸恢復正常，故此效應具有明顯的劑量依賴性。與對照組胺碘酮比較，RPF明顯加快。胺碘酮(amiodarone)是目前最常用的抗心律失常藥物之一，是心臟離子多通道阻滯劑。胺碘酮的電生理作用主要表現在抑制竇房結和房室交界區的自律性，減慢心房、房室結和房室旁路傳導，延長心房肌、心室肌的動作電位時程和有效不應期，延長旁路前向和逆向有效不應期。其對由心室流出道慢反應自律細胞的影響表現在RPF(P＜0.01)的變慢，與此同時可引起心動過緩、房室傳導阻滯等不良反應，實驗結果反映出氧化苦參堿可以干預由胺碘酮所引發的這種電生理反應。酸中毒時，ATP敏感性鉀離子通道激活，同時抑制電壓依賴性的鈣離子通道，全細胞膜片鉗記錄If密度值明顯減小［12］。因此，推測氧化苦參堿是通過影響ICa-L、抑制酸中毒后的鈣超負荷、減少動作電位平臺期鈣離子內流、延長心肌細胞膜Na+-Ca2+的交換時間來發揮其作用的。APD的縮短是折返性心律失常發生的電生理表現之一［13］。本實驗氧化苦參堿延長了酸中毒所導致的APD50、APD90的縮短，這種作用可能與其能在平臺期降低Ca2+的濃度、延長有效不應期、降低異位節律發生率有關，從而顯示了其能抗折返性心律失常的效應。

研究結果表明，氧化苦參堿能夠削減酸中毒對心肌細胞的損害作用，降低酸中毒后心律失常的發生率，促進酸中毒后心臟正常生理功能的恢復，提示氧化苦參堿對酸中毒導致的右心室流出道慢反應自律細胞的異常電生理所致的心律失常有一定干預作用。同時本實驗可為氧化苦參堿藥理機制研究和臨床心律失常中醫用藥治療打下了一定基礎。

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Effects of oxymatrine on the transmembrane potential of myocardial cells of right ventricle outflow tract with acidosis in rabbits

WANG Xue-fang1，LIU Yan-ming2
(1．Department of physiology Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China; 2．Department of CardiologyⅡThe Chinese People's Liberation Army 251 Hospital，Zhangjiakou 075000，China)

Objective:to observe the effects of Oxymatrine on isolated rabbits cardiac cells transmembrane potential induced by acidosis and anti-arrhythmic effects of the mechanism．Methods:By using conventional intracellular microelectrode technique to record transmembrane potential．Results:in simulation acidosis pH6.9 condition，right ventricular outflow tract cell APD50，APD90were significantly shortened，VDD、Vmax and RPF significantly slow;With different doses of Oxymatrine(25、50、100μmol/L)perfusion，appear dose dependence．APD50，APD90prolonged，VDD and RPF significantly more slower．Conclusion:the Oxymatrine to acidosis in rabbits right ventricular outflow tract slow reaction self-discipline cell transmembrane potential to change induced arrhythmia has a significant protective effect．

Oxymatrine;Right ventricular outflow tract;Acidosis; Transmembrane potential

R285．5

B

1006-3250(2015)02-0162-03

2014-11-02

河北省教育廳青年基金資助項目(SQ132004);河北北方學院青年基金資助項目(Q2013032)

王雪芳(1978-)，女，北京人，醫學碩士，從事中藥對心血管保護作用及心臟電生理的臨床與研究。