分枝蟲草液體培養基篩選及其菌絲成分分析*

林 敏，宋 斌，黃 浩，李 挺，沈亞恒

（廣東省微生物研究所，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州，510070）

〈栽培技術〉

分枝蟲草液體培養基篩選及其菌絲成分分析*

林 敏，宋 斌**，黃 浩，李 挺，沈亞恒

（廣東省微生物研究所，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州，510070）

以分枝蟲草（Cordyceps ramosa）菌絲生物量作為指標，研究不同碳源和氮源對分枝蟲草液體培養的影響，采用正交設計試驗法篩選最佳液體培養基配方，并分析菌絲主要營養成分。結果表明，分枝蟲草液體培養基的最佳碳源為甘油，最佳氮源為硝酸鉀，最佳配方是：甘油35 g·L-1、硝酸鉀12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麥芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L；其菌絲的粗蛋白、粗脂肪和總灰分含量分別為32．90%、1．20%和5．89%，其腺苷、多糖和蟲草酸的含量分別為0．805%、5．89%和5．61%；含有17種氨基酸，總含量為23．97%；微量元素鐵、錳、銅、鋅和硒含量分別為76．70 mg·kg-1、5．10 mg·kg-1、3．70 mg·kg-1、33 mg·kg-1和0．176 mg·kg-1，重金屬鉛、砷、汞的含量均符合國家食用菌相關標準。分枝蟲草的液體培養可作為分枝蟲草開發利用的重要途徑。

分枝蟲草；液體培養基；正交試驗；成分分析

中國蟲草種類至今已報道的名稱已經超過130種[1-2]。已開發利用的有冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）、蟬花蟲草 （C.sobolifera）、古尼蟲草 （C. gunnii）、蛹蟲草 （C.militaris）、廣東蟲草 （C. guangdongensis） 等[3-7]。分枝蟲草 [C.ramosa Teng= Elaphocordyceps ramosa (Teng)G.H.Sung,J.M.Sung &Spatafora]也稱分枝團囊蟲草、分枝鹿蟲草、大團囊枒，在分類上隸屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes） 肉座菌目（Hypocreales） 線蟲草科 （Ophiocordycipitaceae） 鹿蟲草屬 （Elaphocordyceps）。分枝蟲草在安徽、福建、甘肅和廣東等省區有分布，民間常用于治療婦科出血癥，包括崩漏、月經過多、更年期子宮出血、產后惡露不絕和宮內節育器所致子宮出血等，是具有藥用價值的中國特有真菌[8-9]。分枝蟲草野生資源貧乏，難于滿足市場需求。林敏等[10-11]對分枝蟲草的生物學特性、子實體生長最適碳氮源和子實體主要成分的研究分析表明，分枝蟲草具有商業應用價值。本文對分枝蟲草液體培養基的最適碳源、最適氮源和最佳配方進行了篩選，并對其菌絲的主要成分進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌株GDIM_CR 4003605，由廣東省微生物研究所微生物資源中心提供，于4℃下保藏備用。

1.1.2 試驗材料

可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖均為分析純，硝酸鉀、蛋白胨、麥芽浸出物、酵母浸膏、瓊脂為生化試劑，黃豆粉、馬鈴薯從市場上直接購買。

1.2 基礎培養基

1.2.1 PDA斜面培養基與配制

PDA斜面培養基組成：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL。取馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g切成小塊，加水煮沸30 min，用4層紗布過濾，濾液加入瓊脂粉20 g，煮沸溶解后加葡萄糖20 g，補水至1 000 mL，pH值自然，分裝10 mL到20 mm×200 mm的試管內，于115℃滅菌20 min，排成斜面，冷卻至常溫后備用。

1.2.2 基礎液體培養基及配制

基礎液體培養基組成：碳源I（10 g·L-1）、氮源I（5 g·L-1）、酵母浸膏（3 g）、麥芽浸出物（3 g），水1 000 mL。取碳源I 10 g·L-1、氮源I 5 g·L-1、酵母浸膏3 g·L-1、麥芽浸出物3 g·L-1，補水至1 000 mL煮沸，用0.1 mol·L-1的HCl及0.2 mol·L-1的NaOH調pH至7.0，每個300 mL三角瓶分裝100 mL液體培養基，于115℃滅菌20 min，冷卻至常溫備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 液體培養與菌絲收集

將供試菌株取出，按常規方法接種于PDA斜面培養基上，置于（25±1）℃下培養活化，待菌絲長滿斜面后于4℃下保藏備用。取活化的斜面菌種，在無菌條件下每瓶接入約0.5 cm2大小的活化菌種8塊，置于（25±1）℃，120 r·min-1振蕩培養10 d即收集培養液。采用干質量法，把收集的培養液，以轉速4 500 r·min-1，離心20 min，傾棄上清液，得到的沉淀即菌絲，置于（60±1）℃烘干至恒重，用分析天平稱量。取3次重復試驗的均值即得菌絲生物量（干重，g·L-1）。

1.3.2 不同碳源對分枝蟲草液體培養菌絲的影響

以蛋白胨5 g·L-1替代基礎液體培養基中的氮源I，以10 g·L-1的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖分別替代基礎液體培養基中的碳源I，依1.2.2配制成5種不同的液體培養基，以基礎液體培養基中的碳源I空白作對照。每種培養基配方設3個重復。以菌絲生物量為指標，研究不同碳源對分枝蟲草液體培養菌絲生長的影響。

1.3.3 不同氮源對分枝蟲草液體培養菌絲的影響

以葡萄糖10 g·L-1替代基礎液體培養基中的碳源I，以5 g·L-1的硝酸鉀、蛋白胨、奶粉、黃豆粉分別替代基礎液體培養基中的氮源I，依1.2.2配制成4種不同的液體培養基，以基礎液體培養基中的氮源I空白作對照。每種培養基配方設3個重復。以菌絲生物量為指標，研究不同氮源對分枝蟲草液體培養菌絲生長的影響。

1.3.4 液體培養基篩選的正交試驗

以研究得到的最適碳、氮源、酵母浸膏、麥芽浸出物為因素，采用L9（34） 正交設計液體培養基（表1）。每組試驗設3個重復。以菌絲生物量為指標，篩選最佳分枝蟲草液體培養基配方。

1.3.5 液體培養菌絲的成分測定

采用最佳液體培養基配方獲得的菌絲，烘干至恒重，粉碎后過20目篩。粗蛋白含量參照GB/ T5009.5-2010/6.1第一法測定[12]；粗脂肪含量參照GB/T 5009.6-2003重量法 (第二法)測定[13]；總灰分含量參照GB 5009.4-2010重量法測定[14]；粗多糖、

表1 正交試驗因素水平表Tab．1 Levels and factors of the orthogonal experiment in this study

蟲草酸、腺苷和蟲草素均參照測馬鶯等測定[15]；氨基酸的含量參照GB/T18246-2000堿水解法進行測定[16]。Fe、Mn參照GB/T5009．90－2003FAAS法進行測定[17]；Cu參照GB/T5009．13－2003FAAS第一法進行測定[18]；Zn參照GB/T5009．14－2003FAAS第一法進行測定[19]；Se參照GB/T5009．93－2010第一法進行測定[20]；Pb參照GB/T 5009．12-2010第一法GFAAS進行測定[21]；Hg參照GB/T 5009．17-2003第二法CVAAS進行測定[22]；As參照GB/T 5009．11-2003第一法HGAFS進行測定[23]。

1．3．6 數據分析

試驗數據采用 Excel 2003、SPSS17．0(SPSS Inc．，Chicago，IL)軟件進行統計分析[24]。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對分枝蟲草液體培養菌絲生長的影響

不同碳源對分枝蟲草液體培養菌絲生長的影響見圖1。

圖1 不同碳源對分枝蟲草液體培養菌絲生長的影響Fig．1 Effect of carbon sources on mycelial growth of Cordyceps ramosa

由圖1可見，分枝蟲草菌絲體在包括對照在內的6種不同供試碳源液體培養基中均能生長，但不同碳源對菌絲生長的影響各有不同。以甘油作碳源時，菌絲生長速度快，菌絲團個大，生物量均值為1．278 g·d-1；其次以葡萄糖作為碳源時，菌絲生長較快，生物量均值為1．159 g·d-1；而以麥芽糖作為碳源時，菌絲生長較差，生物量均值為0．479 g·d-1；最差為對照組，生物量均值僅為0．443 g·d-1。分枝蟲草在不同碳源液體培養基中菌絲生物量由多到少的順序依次是：甘油＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞蔗糖＞麥芽糖＞對照。經方差分析，顯示不同碳源對分枝蟲草液體培養菌絲生物量的影響無顯著差異。

2.2 不同氮源對分枝蟲草液體培養菌絲生長的影響

不同氮源對分枝蟲草液體培養菌絲生長的影響見圖2。

圖2 不同氮源對分枝蟲草液體培養菌絲生長的影響Fig．2 Effect of nitrogen sources on mycelial growth of Cordyceps ramosa

由圖2可見，分枝蟲草菌絲在5種不同供試氮源液體培養基中均能生長，但不同氮源對菌絲生長的影響各有不同。以硝酸鉀為氮源時，菌絲生長最好，生長速度最快，菌絲團個大，生物量均值為1．216 g·d-1；其次以黃豆粉作為氮源時，菌絲生長較好，菌絲團個也大，生物量均值為1．201 g·d-1；奶粉作為氮源時菌絲團個較小，生物量均值為0．676 g· d-1；而對照組則最差，菌絲團個最小，生物量均值僅為0．618 g·d-1。分枝蟲草在不同氮源液體培養基中菌絲生物量由多到少的順序依次是：硝酸鉀＞黃豆粉＞蛋白胨＞奶粉＞對照。經方差分析表明，不同氮源對分枝蟲草液體培養菌絲生物量的影響有顯著差異。

2.3 液體培養基篩選結果

以甘油、硝酸鉀、酵母浸膏、麥芽浸出物為四因素三水平的正交試驗結果見表2。

表2結果表明，甘油35%（3水平），麥芽浸出物10%（2水平），硝酸鉀12%（2水平），酵母浸膏12%（3水平）時，菌絲生物量最高，最佳水平組合為A3B2C2D3。極差R值分析顯示，甘油（A）對分枝蟲草菌絲生物量的影響最大，其次為酵母浸膏（D），再是麥芽浸出物（B），最差是硝酸鉀（C）。因此，分枝蟲草液體培養基的最佳配方為：甘油35 g·L-1、硝酸鉀12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麥芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L。

表2 分枝蟲草液體培養基L9（34）正交試驗結果（n=3)Tab．2 Result on the orthogonal test of L9（34） in the liquidculture medium of Cordyceps ramosa(n=3)

2.4 分枝蟲草液體培養菌絲的成分分析

2．4．1 常見營養活性成分

經檢測，分枝蟲草液體培養菌絲的粗蛋白、粗脂肪和總灰分含量分別為32．90%、1．20%和5．89%。腺苷含量為0．805%、粗多糖含量為5．89%、蟲草酸含量為5．61%，蟲草素的含量低于0．001%。

2．4．2 氨基酸組成與含量

分枝蟲草菌絲氨基酸組成與含量情況見表3。

從表3可以看出，分枝蟲草液體培養菌絲含有17種氨基酸，總含量為23．97%。其中必需氨基酸總含量達到7．82%。谷氨酸含量最高（2．86%），其次是脯氨酸（2．39%）。

2．4．3 微量元素含量

經檢測，分枝蟲草液體培養菌絲的微量元素含量情況見表4。

由表4可以看出，鐵、錳、銅和鋅的含量分別為76．70 mg·kg-1、5．10 mg·kg-1、3．70 mg·kg-1和33mg·kg-1；硒含量（0．176 mg·kg-1） 與子實體（0．046 mg·kg-1）相比[11]，要高出3倍，砷的含量低于0．50 mg·kg-1，而鉛、汞含量低于0．10 mg·kg-1。

表3 分枝蟲草菌絲主要氨基酸組成與含量Tab．3 Composition and content of main amino acids in Cordyceps ramosa mycelium

表4 分枝蟲草菌絲微量元素含量Tab．4 Microelement content in Cordyceps ramosa mycelium

3 小結

在本試驗條件下，分枝蟲草液體培養基的最佳碳源是甘油，最佳氮源是硝酸鉀。這與固體培養基的菌絲生長情況不同[10]，但與子實體的需要情況類似[11]。研究獲得的最佳配方為：甘油35 g·L-1、硝酸鉀12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麥芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L。

本研究結果表明，與分枝蟲草子實體的粗蛋白（17．9%）、粗脂肪（1．02%）、灰分（2．50%）、多糖（0．01%）、蟲草酸 （4．83%） 和氨基酸總含量（12．392%）等成分相比，分枝蟲草菌絲的主要營養成分含量均較高[11]；但其蟲草酸含量遠低于廣東蟲草（46．3%）[25]，與蛹蟲草（5%～7%）相近[26]；與冬蟲夏草相比，成分基本相似，但分枝蟲草腺苷的含量是冬蟲夏草 （0．3755%） 的 2．1倍[27]，是廣東蟲草（0．25%）的3．22倍[25]。重金屬鉛、砷、汞等的含量均符合國家食用菌標準的安全要求[28-30]。

因此，分枝蟲草的液體培養可作為分枝蟲草開發利用的重要途徑，具有潛在的應用前景，值得深入研究。

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書訊

《食用菌營養與烹飪》由湖南省食用菌研究所與中國食用菌協會、中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所共同編寫，主要包括毒菌類的識別方法、食用菌的選購與貯藏、食用菌的營養與保健作用、食用菌經典菜式等內容，重點介紹39種常見食用菌141個菜品的烹飪方法。烹飪方法結合了多地菜肴的特色，兼顧營養、口味、地域及燒、蒸、煮等各種制作技巧的使用，菜式豐富、搭配合理。內容詳實、圖片精美，實用性強。

本編輯部現有少量存書，欲購者可直接匯款至中國食用菌雜志編輯部，本書售價30元，平郵加郵寄費5元，掛號加郵寄費10元，聯系電話0871-65151099。

《中國食用菌》編輯部

Optimization of the Liquid-Culture Medium of Cordyceps ramosa and Composition Analysis of Mycelium

LIN Min,SONG Bin,HUANG Hao,LI Ting,SHEN Ya-heng
(Guangdong Institute of Microbiology,Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology(Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base),Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology,South China,Guangzhou 510070,China)

Effects of carbon and nitrogen sources on the optimization of liquid-culture medium for Cordyceps ramosa mycelial biomass,and the optimum liquid medium screening by the orthogonal design,and the main components of mycelium were analyzed．The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources were glycerol and KNO3respectively,and the optimal medium were glycerol 35 g·L-1,KNO312 g·L-1,yeast extract fermentation 12 g·L-1,malt extract 10 g·L-1and H2O 1 L．The mycelium contained crude protein (32．9%),crude fat(1．2%)and ash (5．89%)．The contents of adenosine,polysaccharide, and cordycepic acid were 0．805%,5．89%and 5．61%．And 17 kinds of amino acids(23．97%)were detected from the mycelium．The microelement levels,such as Fe,Mn,Cu,Zn,Se,were 76．70 mg·kg-1,5．10 mg·kg-1,3．7 mg·kg-1,33 mg·kg-1and 0．176 mg·kg-1,respectively．Levels of the heavy metals,such as Pb,As and Hg,met the edible fungus safety standard levels specified by the Ministry of Health of the People’s Republic of China．The results could provide important way for the development and utilization of C.ramosa．

Cordyceps ramosa;liquid medium;orthogonal design;components analysis

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0017-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．004

廣東省科技項目（2011B020303003）；廣東省科技成果轉化項目（2012NL031）；廣州市科技項目（201300000031）；中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室項目（SKLM 2013-2015）。

林敏（1983-），女，本科，助理研究員，主要從事真菌資源開發利用研究。E-mail:397003483@qq．com

**通信作者：宋斌（1964-），男，本科，研究員，主要從事真菌資源多樣性研究。E-mail:ganoderma@vip．163．com

2015-08-30