miR-370對肝細胞癌的作用及臨床研究*

孫戈 嘉紅云 畢肖紅 余林 陳德基

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）屬于臨床上較為多見的一類惡性腫瘤，一般多指原發性肝癌。原發性肝癌是起源于肝臟上皮或間葉組織的惡性腫瘤，在我國的發病率較高，僅次于胃癌和肺癌。肝細胞癌目前發病機制尚不完全清楚，但大多數學者認為其與環境、生物學因素有關。在大部分研究中發現，肝炎病毒、酒精、化學性刺激、飲水污染等均會導致肝細胞癌的發生。且肝細胞癌患者早期癥狀不明顯，出現癥狀檢查時大多數均為中晚期，中晚期患者常出現消化道出血、肝腎衰竭以及肝臟破裂等并發癥，以致錯過臨床最佳治療時間，致死率極高，成為威脅人類生命安全的疾病之一[1]。在整個醫學發展的過程中，人類一直在和癌癥做斗爭，試圖徹底解決這一威脅人類生命安全的疾病。隨著近年來臨床對腫瘤研究的深入以及基因層面技術的發展，研究發現腫瘤的發生發展是眾多因素造成的結果，其中基因因素在其中占重要部分。隨著醫學水平的不斷提高，人們發現miRNA在肝癌細胞內常表達異常，有學者認為miRNA對腫瘤的發生發展過程中起到重要作用[2]。miRNA是一種內源性非編碼蛋白質的RNA分子，首次在線蟲體內發現，其具有調控編碼基因表達的能力。目前已有1000多種人類miRNA分子，其中部分miRNA在人類的腫瘤疾病中起到重要作用[3]。隨后大量研究證實，miR-370與多種惡性腫瘤的關系密切[4]。但是，關于miR-370與HCC的聯系以及臨床研究尚較少，筆者對55例HCC患者肝癌組織、癌旁組織中miR-370表達以及正常肝組織中miR-370表達進行了檢測，并對比其對臨床指標之間的聯系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究共納入肝癌手術患者55例，均為本院2009年1月-2015年1月收住入院的病例，均經病理診斷符合肝細胞癌診斷標準[5]。另外，25例正常肝組織來源于同時期內進行肝血管瘤手術的病例，同樣經病理診斷符合血管瘤診斷標準[6]。

1.2 使用試劑 Trizol、Ambion RNA 抽提試劑盒、逆轉錄試劑 Super ScriptⅢ、RNA 酶抑制劑（RRI）、肝素、牛血清白蛋白（BSA）、PBS等。

1.3 標本收集 收集的新鮮組織標本均在10 min內處理，每個組織樣本均先置于液氮中快速冷凍，然后置于-80 ℃冰箱內保存待用。所有肝癌組織采集后經病理檢查均證實為肝癌組織，而切緣則未發現腫瘤細胞。癌旁組織采集至少距腫瘤邊緣5 cm以上，并經病理檢查未發現有肝癌細胞。

1.4 研究方法 采用Real-time PCR法檢測肝癌組織、癌旁組織以及正常肝組織中miR-370水平的表達。反應體系如下：SYBR 7.5 μL、cDNA 1.0 μL、PCR primer F（10 μM）0.15μL、PCR primer R（10 μM）0.15 μL、Nuclease-Free Water 5.7 μL，總計 15 μL。反應條件如下：94 ℃預變性30 s，之后94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環后檢測溶解曲線。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件包對數據進行分析，計量資料用（±s）表示，比較采用兩樣本t檢驗，計數資料用百分率（%）表示，采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織、癌旁組織、正常肝組織中miR-370水平表達比較 Real-time PCR結果顯示，正常肝組織、癌旁組織、肝癌組織中miR-370水平分別為（0.857±0.021）、（0.003±0.001）、（0.001±0.000 01），呈現依次遞減的趨勢，三組間兩兩比較，差異均具有統計學意義（P<0.01）。

2.2 miR-370表達與HCC標本臨床特性的相關性研究 根據miR-370在肝癌組織及癌旁組織中表達的中位數，可以分為高表達組與低表達組，miR-370與臨床指標關系顯示，miR-370低表達者在較大腫瘤、TNM分期較晚、腫瘤侵犯血管、肝內有衛星灶、腫瘤無包膜等較為多見，比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 miR-370表達與HCC標本臨床特性的相關性研究 例

3 討論

HCC是目前臨床較為常見的惡性腫瘤之一，于東南沿海地區發病較多，一般發病年齡在40~50歲，多見于男性，臨床目前尚未對該疾病的明確發病機制做出規定。但大多數學者均表明，環境因素、肝硬化、病毒性肝炎以及相關化學致癌物質（如黃曲霉素）感染引起。患病時多表現出肝區疼痛，其作為首發癥狀，大多數表現出持續性刺痛、脹痛亦或是鈍痛，這與腫瘤快速增長具有較強聯系；其次還會發生全身性及消化道癥狀，例如食欲減退，消瘦乏力、腹脹腹瀉、惡心嘔吐等，隨著病情發展，患者還可能表現出貧血及下肢水腫等癥狀；肝腫大及肝癌轉移等[7]。目前臨床治療主要依據個體情況，對于不同階段采用針對性綜合治療的方式，以提高整體治療效率以及患者的生存質量。手術治療一直是肝癌患者治療首選方案，主要包括根治性肝切除以及姑息性肝切除術等；某些患者不宜進行手術治療則可對其進行肝動脈化療栓塞、激光、冷凍、微波等治療手段；此外還可對患者進行藥物治療、放射治療、生物治療等[8]。

目前研究表明，miR-370與臨床多種惡性腫瘤的發生、發展有著較為密切的聯系[9-10]。miR-370位于人類14號染色體DLKI-DIO3印記基因區域。以往對miR-370研究發現，其主要參與了脂代謝的過程，在過程中起到調節作用。而還有研究發現，miR-370可促進miR-122表達，使二酰基甘油酰基轉移酶-2以及元件結合蛋白-1c呈高表達狀態，使甘油三酯聚集于肝臟[11]。而在高脂血癥等肝臟疾病患者中表達程度均高于正常健康人，有學者認為miR-370可能與肝臟代謝及發育情況有關[12]。近些年來，人們對腫瘤研究的不斷深入，發現腫瘤的發生是多因素調控的結果，尤其是遺傳學機制在其中起到重要作用[13]。在既往的試驗中，人們已經對miRNA家族有較深入的研究，發現其中miR-21、miR-221、miR-224等miRNA在肝細胞癌中均有較高表達，并可促進肝細胞癌的發生，然而目前對miR-370的研究較少。孟凡龍等[14]對miR-370研究顯示，在口腔鱗狀上皮細胞癌患者癌細胞中miR-370的表達低于正常健康人。在其進一步研究中發現，口腔癌患者miR-370表達越低，癌細胞越容易發生淋巴結轉移。陳彪[15]的對照研究中也發現，相對于膽管細胞癌患者，正常健康人的膽管細胞中miR-370表達較高，膽管細胞癌患者癌細胞中miR-370表達明顯下調。本研究對本院肝細胞癌患者及正常肝組織進行miR-370檢測，結果顯示，正常肝組織中miR-370存在高表達，而肝癌組織中miR-370表達較低，癌旁組織中miR-370表達則介于兩者之間，上述結果呈現依次遞減的趨勢，可見miR-370在癌細胞中表達較低。值得注意的是，癌旁組織中miR-370表達與正常肝組織相比，已經出現了顯著的降低。導致該結果的原因可能與我國大部分HCC患者是由肝硬化基礎上發展而來的，因此癌旁組織并非正常的肝組織[16]。

本文分析了miR-370表達與HCC患者臨床資料間的關系。結果發現miR-370表達與腫瘤大小、TNM分期、腫瘤侵犯血管、肝內有衛星灶、腫瘤無包膜等有著較為密切的聯系（P<0.05）。上述結果說明，miR-370表達越低，HCC患者的惡性化程度就越高。進一步說明miR-370的表達與肝癌的發生與發展過程中發揮著密切的作用。此外，miR-370低表達HCC患者更容易出現腫瘤血管侵犯、衛星灶以及包膜缺失等，說明miR-370的表達與肝癌細胞的遷移、侵襲以及血管形成等惡性生物學行為存在一定程度的抑制作用，值得臨床研究的進一步深入。本研究發現miR-370的表達與AFP水平、腫瘤分化程度以及腫瘤數量等無明顯的聯系，這可能與本研究納入的樣本量較小以及分組間標本分布不均存在一定的關系。因此，增加樣本量，平衡標本分布，能夠更為準確的反應miR-370表達與HCC之間的聯系。

綜上所述，miR-370在肝細胞癌中呈現較低表達，表達水平較低者容易出現較大腫瘤、TNM分期較晚、腫瘤侵犯血管、肝內有衛星灶、腫瘤無包膜等。

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