慢性乙型病毒性肝炎濕熱量化的臨床探討*

陳佩嬋 侯延平 鄭振 劉先秒 譚慶林

乙型病毒性肝炎是人類的重要疾病類型之一，是嚴重影響全球公共衛生的重大問題。全球20億人群曾感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中3.5億人為慢性乙型病毒性肝炎，且終身攜帶乙型肝炎病毒，最終并發肝硬化或肝臟惡性腫瘤而死亡人數高達100萬人/年[1-2]。近年來，有關于慢性乙型病毒性肝炎的中醫辨證分型與T細胞亞群、白細胞介素、載脂蛋白等量化指標關系的研究報道[3]。同時有慢性乙型肝炎臨床癥狀與熱休克蛋白70的文獻研究報道[4]。但關于尿液水通道蛋白2 （AQP-2）、血清休克蛋白70（HSP70）和外周血T淋巴細胞亞群與慢性乙型病毒性肝炎濕熱證的關系研究甚少。本研究通過檢測尿液水通道蛋白2、血清熱休克蛋白70和外周血T淋巴細胞亞群等指標的變化，以探討慢性乙型病毒性肝炎濕熱證的量化規律，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月-2013年12月高要市人民醫院消化內科住院部西醫診斷慢性乙型病毒性肝炎，中醫辨證屬于濕熱證患者101例，排除甲型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、丁型病毒性肝炎、戊型病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化、肝纖維化和肝臟惡性腫瘤等肝臟疾病，將患者分為兩組，其中慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證者為A組，共50例，其中男32例，女18例，年齡19~65歲，平均（45.23±6.32）歲，慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證者為B組，共51例，其中男34例，女17例，年齡19~64歲，平均（45.15±6.24）歲。同期選取肝功能正常，未合并肝臟疾病和濕熱證的健康人群作為正常組，共50例，其中男30例，女20例，年齡18~66歲，平均（45.44±6.01）歲，三組間性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 慢性乙型病毒性肝炎西醫診斷標準 參考2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》標準[5]，血清乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）或血清HBV-DNA陽性大于6個月以上，血清丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）大于正常上限2倍而低于正常上限的10倍。

1.3 濕熱證中醫診斷標準 濕熱證的辨證參照《中醫內科學》（第6版，王永炎主編）黃疸章節中的辨證分型擬定[6]。（1）證候表現為身目發黃如橘，無發熱或身熱不揚，頭重身困，嗜臥乏力，胸脘痞悶，厭食油膩，納呆嘔惡，口粘不渴，小便不利，便稀不爽，舌苔厚膩微黃，脈濡緩或弦滑者辨為濕偏重證。（2）證候表現為全身皮膚及白睛發黃，黃疸重，色澤鮮明，壯熱口渴，心中懊惱，脅脹痛而拒按，惡心嘔吐，納呆，小便赤黃或短少，大便秘結，舌紅苔黃膩或黃糙，脈弦數或滑數者辨為熱偏重證。

1.4 檢測方法 （1）尿液水通道蛋白2（AQP-2）：留取晨尿20 mL，尿液樣本收集后離心，取上清液，放入-20 ℃冰箱凍存待測。采用酶聯免疫吸附測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA 法）檢測尿液水通道蛋白2（AQP-2）水平，各試劑及尿液標本在檢測前平衡至室溫，采用0.05% SDS-PBS等倍稀釋后，4 ℃過夜，漂洗封閉后滴加一抗（兔抗鼠1∶1000，經3%BSA-PBS稀釋），37 ℃環境下孵育2 h，漂洗后滴加二抗（1∶2000），37 ℃環境下孵育1.5 h，顯色終止反應，采用酶標儀于450 nm處測定吸光度（OD值）。（2）采用ELISA 法檢測血清熱休克蛋白70（HSP70），空腹抽取靜脈血2~3 mL，血標本抽取后隨即分離出血清放入-20 ℃冰箱凍存待測。用ELISA方法測定血清樣品中HSP70含量，各試劑及血液標本在檢測前平衡至室溫，采用PBS緩沖液洗滌，4 ℃過夜，漂洗封閉后滴加一抗，常溫下孵育2 h，PBS緩沖液洗滌后滴加二抗，常溫下孵育1.5 h，顯色終止反應，采用酶標儀450 nm處測定吸光度。（3）外周血T淋巴細胞亞群：采用抗體致敏的紅細胞花環試驗間接測定外周血T淋巴細胞亞群，試劑由武漢生物制品研究所提供，采用COULTER流式細胞儀測定，以%表示。

1.5 統計學處理 本研究數據采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，實驗結果的數據類型均為計量資料，屬完全隨機設計的多組均數比較，以 （±s）表示，采用One-Way ANOVA對各組實驗結果進行方差分析，分析前首先考察方差齊性，方差齊則組間多重比較用LSD法檢驗，方差不齊則組間多重比較用Dunnett T3法檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組間AQP-2和HSP70的比較 A組AQP-2明顯高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義（q=15.93，P<0.05），B組AQP-2明顯高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義（q=14.51，P<0.05），且A組AQP-2明顯高于B組，兩組比較差異具有統計學意義（q=9.57，P<0.05）。A組HSP70明顯高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義（q=7.21，P<0.05），B組HSP70明顯高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義（q=14.89，P<0.05），且B組HSP70明顯高于A組，兩組比較差異具有統計學意義（q=4.41，P<0.05），見表1。

表1 組間AQP-2和HSP70的比較（x-±s）

2.2 組間外周血T淋巴細胞亞群的比較 A組、B組和對照組三組間CD3+比較差異無統計學意義（P>0.05），A組CD4+、CD4+/CD8+均明顯低于對照組，兩組比較差異均具有統計學意義（q=12.31，22.45，P<0.05），B組CD4+、CD4+/CD8+均明顯低于對照組，兩組比較差異均具有統計學意義（q=11.88， 20.74，P<0.05），A組和B組CD4+、CD4+/CD8+比較差異均無統計學意義（P>0.05）；A組CD8+明顯高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義（q=10.70，P<0.05），B組CD8+明顯高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義（q=12.64，P<0.05），A組和B組CD8+比較差異無統計學意義（P>0.05），見表 2。

表2 組間外周血T淋巴細胞亞群的比較（x-±s）

3 討論

我國是病毒性肝炎的高發地區，每年平均發病率約為（120~140）/10萬，其中以乙型病毒性肝炎為主[7]。我國乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染率高達57.6%，全國至少6億人曾感染過乙型肝炎病毒[8]。慢性乙型病毒性肝炎（Chronic viral hepatitis B，CH-B）嚴重威脅人類健康。目前關于慢性乙型病毒性肝炎的研究主要涉及中醫中藥防治、流行病學、臨床醫學、預防醫學、生物醫學和病毒學等多方面。其中中西醫結合治療慢性乙型病毒性肝炎的臨床療效顯著。參照中醫辨證理論，可將慢性乙型病毒性肝炎分為多種證型，濕熱辯證是慢性乙型病毒性肝炎中醫辯證的關鍵環節[9]。慢性乙型病毒性肝炎濕熱證臨床表現多種多樣，由于慢性乙型病毒性肝炎濕熱證在疾病發生和發展過程中，存在濕偏重、熱偏重和濕熱并重等病理改變，對臨床診斷存在一定難度[10]。因此，如何改善慢性乙型病毒性肝炎濕熱證的診斷效能是臨床研究的重中之重，在濕熱證文獻調查研究的基礎上結合慢性乙型病毒性肝炎進行濕熱證、濕偏重和熱偏重的量化研究[11]。通過檢測慢性乙型病毒性肝炎濕熱證患者AQP-2、HSP70和外周血T淋巴細胞亞群的表達等相關指標，從生化、免疫和分子生物學等視角探討慢性乙型病毒性肝炎濕熱證患者的臨床量化規律，以探討濕偏重和熱偏重的作用機理，從而進一步揭示濕熱證的本質[12]。對濕熱證的濕、熱量化，濕熱病的臨床診斷水平的提高，對病情預后的推斷、理法方藥的確定和更好的指導臨床治療有著重大的意義。

濕熱證是嶺南地區的常見病癥，其與氣候、飲食、體質和病原微生物感染等因素緊密相關，且其臨床表現多樣化。目前初步證實濕熱證與病原微生物感染緊密相關，脾胃濕熱與幽門螺旋桿菌感染緊密相關，而肝臟濕熱與乙型肝炎病毒緊密相關[13]。濕熱證與細胞免疫功能顯著相關，胃腸濕熱證外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+和CD4/CD8比值均明顯低于正常對照組，差異具有顯著性。胃腸濕熱證患者血清胃泌素、胃動素水平均顯著高于健康體檢者[14]。相關研究報道顯示，脾胃濕熱患者紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性、紅細胞ATP含量和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性經胰島素代謝或基礎代謝刺激后上述指標均明顯高于脾胃氣虛患者，而17-羥基化皮質類固醇含量則處于正常范圍內，上述研究證實濕熱證存在細胞組織物質能量代謝的亢進狀況，可能為機體對濕熱病邪和內源性調節因子作出的代謝性效應。因此，濕熱證與微生物感染、免疫功能和物質代謝的生化指標顯著相關，但關于慢性乙型病毒性肝炎濕熱證的量化指標變化及其意義研究甚少。

濕熱證病理過程較為復雜，涉及多臟器、多系統的功能及其結構的改變。由于體質對濕、熱感覺反應的差異性，濕熱證普遍存在濕偏重和熱偏重的區別。近年來關于濕熱證量化的實驗研究已經取得一定的進展。濕熱證動物模型體內腎臟內髓質和尿液水通道蛋白2表達對于濕熱證“濕”的形成、“濕”的量化程度和“濕”的偏重具有重要的意義[15]。濕偏重型和熱偏重型AQP-2水平較正常體檢者顯著增高，其中濕偏重型AQP-2水平顯著高于熱偏重型[16]。濕熱證在多種因素作用下，特別是大腸桿菌作用下，濕偏重型和熱偏重型中醫辨證血漿淋巴細胞HSP70水平顯著增加，同時，熱偏重型血漿淋巴細胞HSP70增加程度較濕偏重型更為明顯[17]。另一方面，濕熱證患者CD4+、CD4+/CD8+顯著低于正常體檢者，CD8+顯著高于正常體檢者，提示濕熱證形成過程中，刺激CD8+免疫細胞產生，抑制CD4+產生，導致T淋巴細胞介導的細胞免疫功能處于明顯的抑制狀態，機體識別和殺傷抗原性物質功能顯著降低[18]。

結合本研究結果顯示，（1）慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者尿液水通道蛋白2明顯高于健康體檢者，兩者比較差異具有統計學意義；慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者AQP-2明顯高于康體檢者，兩者比較差異具有統計學意義；其中慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者尿液水通道蛋白2明顯高于慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者，揭示了慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者AQP-2增高幅度最大，其次為慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者，兩者AQP-2水平均明顯高于健康體檢者，因此，AQP-2指標可作為慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者較為敏感的量化指標。（2）慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者血清HSP70明顯高于健康體檢者，熱偏重證患者血清HSP70明顯高于健康體檢者，慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者血清HSP70明顯高于慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者，揭示了慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者血清HSP70增加幅度最大，其次為慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者，兩者血清HSP70均明顯高于健康體檢者，因此，血清HSP70可作為慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者病情程度較為敏感的量化指標。（3）慢性乙型病毒性肝炎濕熱證患者CD4+、CD4+/CD8+明顯降低，CD8+明顯增高，結合CD4+、CD8+在細胞免疫功能中的作用，進一步證實了慢性乙型病毒性肝炎濕熱證導致細胞免疫抑制的病理狀態。

綜上所述，慢性乙型病毒性肝炎濕熱證存在AQP-2、HSP70和CD8+等指標顯著增加現象，同時存在CD4+、CD4+/CD8+等指標顯著降低現象，其中慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證者尿液水通道蛋白2增加程度更明顯，熱偏重證者血清HSP70增加程度更明顯。

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