絮凝、吸附和超濾預處理谷氨酰胺發酵液研究

張偉　鐘麗梅　劉峰

摘 要：為進一步純化和精制谷氨酰胺，采用絮凝、離心、活性炭吸附和超濾等方法對發酵液進行了預處理。實驗優化了絮凝的最佳條件，研究了活性炭對色素的吸附能力，嘗試了3種超濾膜的去蛋白和脫色效果。結果表明，殼聚糖濃度為250mg/L，殼聚糖和海藻酸鈉濃度比為1∶3，pH控制在5左右，溫度在25℃左右，攪拌強度為80r/min，絮凝時間為15min，絮凝效果最好，菌體去除率超過97%。用GH-15活性炭對絮凝后的發酵液脫色，脫色率達75%。使用截留分子量為6 000的超濾膜，脫色率進一步提高了43.82%，蛋白去除率為75.33%。

關鍵詞：谷氨酰胺；殼聚糖；絮凝；吸附；超濾

中圖分類號 TS20 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）06-19-04

Pretreatment on Glutamine Fermentation Broth by Flocculation，Adsorption and Ultrafiltration

Zhang Wei et al.

（College of Life Science，Fujian Normal University，Fuzhou 350108， China）

Abstract：In order to purify L-glutamine further，flocculation，centrifugalization，adsorption and ultrafiltration were used to pretreat fermentation broth.In this study，the flocculation condition has been optimized，the adsorption capacity of activated carbon （GH-15） for pigments was researched and the effect on removing proteins and decolourization of ultrafiltration was studied.This study showed the optimal condition of flocculation was as follows： chitosan 250mg/L，sodium alginate 750mg/L，pH 5，temperature 25℃，stirring intensity 80r/min，response time 15min，the removal rate of bacterial body exceeded 97%.The decolourization ratio was up to 75% with GH-15.The decolourization ratio incresed by 43.82% and the removal rate of proteins was 75.33% using the UF membrane with molecular weight cut off 6000.

Key words：L-glutamine；Chitosan；Flocculation；Adsorption；Ultrafiltration

L-谷氨酰胺是L-谷氨酸r-基酰胺化的一種氨基酸，是構成蛋白質的基本氨基酸之一，在機體內含量豐富，對于生物體的代謝具有極其重要的作用，同時也是一種極具開發前途的新藥[1-3]。現階段，谷氨酰胺的生產主要采用發酵法[4]，但由于發酵法產生的發酵液成分復雜，含有大量的菌體、蛋白質、色素等其它物質，這些雜質對于谷氨酰胺的提取與精制帶來了很大困難，最終影響到谷氨酰胺的收率與質量。因此，在提取純化之前，必須對發酵液進行預處理，目前去除菌體、蛋白質和色素等雜質的方法主要有絮凝、離心、吸附、微濾，超濾等，這些方法單獨使用效果不佳，必須結合使用才能達到理想的效果。

殼聚糖是一種新型的高分子絮凝劑。海藻酸鈉是一種天然多糖，具有很好的濃縮溶液、形成凝膠和成膜的能力，與絮凝劑殼聚糖結合使用，具有很好的助凝能力[5]。殼聚糖呈陽離子型，通過“橋架”作用和壓縮膠體雙電層結構而絮凝，對于帶負電荷的菌體、蛋白具有很好的絮凝效果。對于蛋白、色素和多糖等大分子物質，超濾有很好地去除效果[6]。在超濾前，先進行絮凝、離心和吸附，大部分懸浮物被去除，在一定程度上減輕了超濾膜的污染問題。本文采用絮凝、離心、活性炭吸附和超濾等方法對谷氨酰胺發酵液進行了預處理，為谷氨酰胺生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和設備 谷氨酰胺發酵液（本實驗室提供）；殼聚糖；海藻酸鈉；GH-15活性炭，其它試劑均為AR。Ultrospec 2100 pro（Amersham Biosciences）；ZNCL-B（予華儀器有限責任公司）；SORVALL RC6+ Centrifuge（Thermo Scientific）；SBA-40D型生物傳感自動分析儀（山東省科學院生物研究所）；PHS-3B型酸度計（上海精密科學儀器有限公司）；QuixStand臺式膜過濾分離系統。

1.2 實驗方法

1.2.1 絮凝實驗 取100mL谷氨酰胺發酵液于200mL燒杯中，調節其pH。開啟溫度攪拌器，設定好溫度和轉速后，將盛有發酵液的燒杯放在其上，待溫度達到設定溫度后，將殼聚糖和海藻酸鈉慢慢加入其中，在400r/min攪拌速度下使發酵液和絮凝劑助凝劑充分接觸，2min后設定絮凝攪拌速率。

1.2.2 菌體去除率測定 以原發酵液菌含量為100%，純水為0，原發酵液通過稀釋，可以制備一系列菌含量不同的溶液，通過這些溶液和其對應的OD600值，可以制備兩者之間的標準曲線。

1.2.3 沉淀和活性炭吸附實驗[7] 待絮凝結束后，在8 000r/min下離心沉淀，取上清液進行活性炭吸附。吸附條件為：炭量60g，柱高30cm，柱直徑2.5cm，流速93mL/h，進樣液體積650mL。在390nm處測定吸光度，脫色率DR（%）=（A0-A）/A0×100，式中：A0為脫色前吸光度，A為脫色后吸光度。

1.2.4 超濾實驗 發酵液經絮凝、離心沉淀和活性炭吸附后，進行超濾，超濾流程如圖1所示。

1.2.5 谷氨酰胺檢測 采用酸解-酶膜聯用法[8]。

1.2.6 蛋白含量測定 考馬斯亮藍法。

2 結果與分析

2.1 絮凝最佳優化條件實驗

2.1.1 殼聚糖濃度對絮凝效果的影響 由圖2可知，當殼聚糖濃度為250mg/L時，絮凝清液OD600值降到1左右，對應的菌體除去率達到90%。當殼聚糖濃度小于250mg/L時，絮凝劑用量不足，許多菌體還未與絮凝劑絮凝而留在溶液中。當殼聚糖濃度大于250mg/L時，絮凝劑加入過量，菌體形成帶絮顆粒，其不能形成網狀狀態，使得絮凝顆粒小，因此絮凝效果差。

2.1.2 殼聚糖和海藻酸鈉的比例對絮凝效果的影響 為了增強絮凝效果，選擇海藻酸鈉作為助凝劑。由圖3可知，殼聚糖和海藻酸鈉濃度之比為1∶3時，絮凝效果最好，菌體去除率接近96%，比殼聚糖單獨使用提高6%，助絮凝效果良好。[98.00

2.1.3 pH值對絮凝效果的影響 有研究表明：在pH較低時，殼聚糖和蛋白結合體系更加穩定，對外抵抗能力增強，造成這種現象的原因是低的pH有利于增強其氫鍵和靜電力[9]。由圖4可知，pH較低時，絮凝效果較好，pH在3～7，菌體去除率超過80%，其中pH值為5左右效果最佳，菌體去除率超過95%。pH值在3～5時，加入殼聚糖，殼聚糖和菌體表面作用蛋白、發酵液中少數游離蛋白結合，通過絮凝作用，菌體和少數游離蛋白沉淀下來。

2.1.4 溫度對絮凝效果的影響 由圖5可知，當溫度在25℃左右時，絮凝效果最佳，菌體去除率超過95%。當溫度較低時，由于絮凝劑與菌體結合蛋白作用頻率低，絮凝反應慢，效果較差；當溫度較高時，雖然絮凝劑與菌體結合蛋白作用頻率增高，但絮凝體細小，沉降效果差，因此菌體去除率較低。

圖5 溫度對絮凝效果的影響

2.1.5 攪拌時間對絮凝效果的影響 由圖6可知，絮凝時間以15min左右為宜。反應時間太短，許多菌體還未絮凝，菌體去除率較低；反應時間太長，由于攪拌，已經形成的絮凝團在剪切力的作用下遭到破壞，絮凝效果也較差。

2.1.6 攪拌強度對絮凝效果的影響 由圖7可知，當攪拌強度在80r/min左右時，絮凝效果最佳，發酵液OD600接近0.5，菌體去除率達到95%左右。當攪拌強度較低時，有礙于絮凝劑與菌體結合蛋白的接觸，不利于絮凝；當攪拌強度較大時，機械剪切力增強，不利于大的絮凝團的形成，而且不利于絮凝團的沉降。

2.1.7 絮凝對谷氨酰胺收率的影響以及絮凝的去蛋白效果 在絮凝反應前后，分別對發酵液的谷氨酰胺含量進行了檢測，檢測結果見表1。由表1可以看出，絮凝對谷氨酰胺的影響甚小，發酵液經絮凝后，谷氨酰胺的收率可達到97%左右；同時，絮凝去蛋白效果不明顯，殼聚糖作為絮凝劑處理谷氨酰胺發酵液時，不能起到去蛋白的作用。

2.2 活性炭脫色實驗 絮凝離心后取上清液進行脫色，脫色效果和活性炭對谷氨酰胺收率的影響見表2。由表2可知，GH-15活性炭脫色效果明顯，脫色率超過75%，且對谷氨酰胺的收率影響小。

2.3 超濾實驗 選擇3種中空纖維濾柱（A、B、C），其截留分子量分別為30 000、10 000和6 000。在超濾前后，分別對發酵液的OD390值和蛋白質濃度進行檢測，結果見表3。由表3可知，發酵液經超濾后，脫色和去蛋白效果明顯，蛋白質去除率達60%～80%，脫色率進一步提高，經過活性炭吸附和超濾后，總的脫色率達85%；A、B、C相比較，C膜由于孔徑小，脫色率和去蛋白率比A膜和B膜高，但增幅效果不明顯，因此，在實際應用中，最好使用截留分子量稍大的濾膜。

3 結論

（1）殼聚糖用作谷氨酰胺發酵液菌體去除絮凝劑，絮凝效果較好，而且殼聚糖絮凝時幾乎不影響谷氨酰胺的收率。

（2）絮凝的最佳條件：殼聚糖濃度為250mg/L，殼聚糖和海藻酸鈉濃度為1∶3，pH控制在5左右，溫度在25℃左右，攪拌強度為80r/min，絮凝時間以15min為宜。

（3）GH-15活性炭對谷氨酰胺發酵脫色明顯，脫色率達到75%，對谷氨酰胺幾乎不造成損失。

（4）超濾去蛋白效果明顯，去蛋白率達到60%～80%，而且對于脫色有一定的增益作用。

參考文獻

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（責編：張宏民）